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《江南大学》 2016年
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代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究

吴殿辉  
【摘要】:氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,简称EC)是存在于黄酒中的潜在致癌物,黄酒中EC含量偏高的问题由来已久,是我国黄酒的一个重要安全隐患。在黄酒发酵过程中,受氮代谢阻遏效应(Nitrogen catabolite repression,简称NCR效应)的影响,EC前体物——尿素在发酵液中的过量积累是形成EC的主要原因。因此,通过降低发酵液中的尿素含量,可以减少黄酒中EC的形成。本研究以用于黄酒生产的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae N85为研究对象,通过代谢工程改造敲除酿酒酵母精氨酸酶编码基因CAR1以及高效表达脲基酰胺酶编码基因DUR1,2,阻断了工程菌N85DUR1,2-c的尿素生成途径并强化其尿素的降解途径,减少了黄酒发酵过程中尿素的积累和EC的形成。在黄酒厂进行了工业化生产试验,并考察了工程菌的生长和发酵性能。此外,本研究通过代谢工程改造研究了酿酒酵母瓜氨酸代谢途径对黄酒中瓜氨酸和EC含量的影响。(1)通过敲除工业黄酒酵母S.cerevisiae N85的HO基因以及单倍体孢子分离,获得了不同结合型(a型和α型)的单倍体菌株,利用Cre/loxP系统切除了HO基因敲除组件带入单倍体基因组的抗性基因KanMX,最终获得了不含外源抗性基因且不能发生接合型转变的酿酒酵母单倍体菌株。并通过敲除URA3基因构建了尿嘧啶缺陷型单倍体突变株,为后续的基因工程改造提供了出发菌株和筛选标记。(2)利用“自克隆”代谢改造方法,构建了CAR1缺失的杂合工程菌N85-c1和纯合工程菌N85-c2。黄酒发酵实验表明,工程菌N85-c1与亲本菌株N85发酵液中尿素和EC的含量相当,分别为35.8±1.5 mg·L-1和21.2±0.6μg·L-1。而工程菌N85-c2黄酒发酵液中尿素和EC的含量分别为4.9±0.3 mg·L-1和10.3±0.4μg·L-1,较亲本菌株N85分别降低了86.9%和50.5%。说明黄酒中绝大部分的尿素是由酿酒酵母代谢精氨酸产生的,而且酿酒酵母的单个CAR1等位基因表达的精氨酸酶足以降解精氨酸生成大量的尿素,形成数量可观的EC。(3)分别以酿酒酵母N85和N85-c2的单倍体为出发菌株,通过高效表达DUR1,2基因,构建了纯合工程菌N85DUR1,2和N85DUR1,2-c。黄酒发酵实验表明,纯合工程菌N85-c2、N85DUR1,2和N85DUR1,2-c发酵液中尿素的含量较亲本菌株N85分别降低了86.9%、75.6%和89.1%,EC含量分别降低了50.5%、40.0%和55.3%。说明通过代谢工程改造降低黄酒发酵液中尿素含量的两条途径(敲除CAR1基因——阻断尿素的生成或高效表达DUR1,2——强化尿素的降解)中,敲除CAR1的策略更为有效,而结合两个代谢改造策略构建的工程菌——N85DUR1,2-c降低黄酒发酵液中尿素的含量并减少EC形成的效果最佳,发酵液中尿素和EC的含量仅为4.7±0.5 mg·L-1和19.6±2.0μg·L-1,而且遗传稳定性好,具有工业化应用的潜力。(4)工程菌在偏好型氮源培养基中对尿素积累和代谢的研究表明,代谢工程改造不仅阻断了工程菌N85DUR1,2-c生成尿素的途径,而且DUR1,2的高效表达也缓解了发酵液中谷氨酰胺、谷氨酸等偏好型氮源对其利用尿素的抑制作用。所以在黄酒发酵过程中,工程菌N85DUR1,2-c的DUR1,2基因的转录和表达不受氮代谢阻遏效应的影响,能够有效地降低发酵液中尿素的含量,从而减缓了尿素与乙醇反应生成EC的速率,达到减少EC形成的目的。(5)通过敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因ARG3以及高效表达精氨基琥珀酸合成酶编码基因ARG1和精氨酰琥珀酸裂解酶编码基因ARG4,考察了酿酒酵母瓜氨酸代谢途径对发酵液中瓜氨酸和EC含量的影响。黄酒发酵实验表明,敲除ARG3的工程菌N85-arg3与亲本菌株N85发酵液中瓜氨酸和EC的含量基本相同,说明酿酒酵母的瓜氨酸合成途径不是黄酒发酵液中瓜氨酸的主要来源。高效表达ARG1和ARG4的工程菌N85ARG1,4和N85ARG1,4-arg3发酵液中瓜氨酸的含量分别降低了24.1%和20.4%,但是工程菌N85ARG1,4和N85ARG1,4-arg3发酵液中EC的含量分别增加了23.8%和28.5%。说明单纯通过强化酿酒酵母对瓜氨酸的利用来降低黄酒发酵液中EC含量的效果不明显。(6)通过单因素实验考察了黄酒发酵工艺对工程菌降低尿素和EC能力的影响,结果表明,酵母接种量、发酵温度以及麦曲添加量等工艺参数对工程菌N85DUR1,2-c低产尿素和EC的性能没有明显的影响。500 L黄酒放大实验表明,工程菌N85DUR1,2-c与亲本菌株N85发酵过程中酒精度、总糖、氨基酸态氮以及总酸等理化指标含量的变化趋势基本相同,发酵结束时,发酵液中常规理化指标含量正常,说明工程菌N85DUR1,2-c在接近工厂生产条件的情况下发酵正常。而N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为3.0mg·L-1和16.6μg·L-1,较亲本菌株N85降低了91.5%和55.7%。(7)在工厂进行的50 kL生产试验表明,工程菌N85DUR1,2-c成品黄酒中酒精度、总糖、总酸等理化指标含量正常,除异戊醇和异丁醇含量较低以外,其他风味物质的含量与亲本菌株N85基本没有差异,符合黄酒国标的要求。工程菌N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为2.4±0.2 mg·L-1和14.9±0.6μg·L-1,较N85菌株分别降低了90.7%和54.6%,且贮存过程中EC含量增加缓慢。说明本研究通过食品安全级代谢工程改造构建的工程菌N85DUR1,2-c在不影响成品黄酒品质的情况下,不仅能够有效地降低发酵液中尿素和EC的含量,而且还可以减缓长期储酒过程中EC的形成速率,减少了黄酒中EC的含量,提高了其饮用安全性。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TS262.4;TQ920.6

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