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《江南大学》 2017年
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眼点微拟球藻二十碳五烯酸高效积累及其提取纯化研究

王玉仙  
【摘要】:眼点微拟球藻(Nannochloropsis oculata)富含二十碳五烯酸(EPA,eicosapentaenoic acid),其中EPA具有较高的保健和药用价值。本研究分别从微拟球藻培养策略研究、EPA提取方法选取及纯化方法优化出发,以期提高微拟球藻EPA纯度及产量。通过光强实验发现,微拟球藻比生长速率随光强增加而增加,当光强从1000 lux增加到9000 lux,比生长速率从0.25 d~(-1)增加至0.54 d~(-1),增加了116%。提高光强会降低叶绿素a含量,增加油脂和总糖含量,而对胞内蛋白含量的影响较小。随着光强增加,EPA相对含量从25.5%降至13.1%,EPA产量由5.1 mg·L~(-1)降至2.7 mg·L~(-1)。通过氮源种类实验发现,采用乙酸铵作为氮源对微拟球藻生长最佳,其生物量可达0.41 g·L~(-1),比硝酸钠、氯化铵、尿素和硝酸铵组分别高出17.1%、5.1%、7.9%和10.8%。硝酸钠组的叶绿素a含量高于其他组,乙酸铵组的油脂和蛋白含量均高于其他组,氮源种类对胞内总糖含量的影响较小。硝酸钠组EPA相对含量最高为27.1%,乙酸铵组EPA产量最高为15.6 mg·L~(-1)。通过两阶段氮源补料实验发现,培养过程补加乙酸铵,可同时提高微拟球藻EPA相对含量及产量,通过优化乙酸铵补料时间,确定最佳补料时间为第11天,EPA相对含量及产量分别为24.3%和26.8 mg·L~(-1),较对照组分别提高了7.5%和22.4%。通过比较3种提取方法对微拟球藻EPA提取率和脂肪酸组成影响发现,采用直接皂化法对未研磨的微拟球藻粉进行EPA提取效果最佳,EPA提取率达到39.4%,比皂化法提取研磨微拟球藻粉、B-D法提取研磨和未研磨藻粉、超临界萃取法提取研磨和未研磨藻粉分别提高了10.4%、6.8%、82.4%、275.2%和579.3%。利用单因素影响实验确定了三个要素的响应面中间点:尿素/脂肪酸3,95%乙醇/尿素5,包合温度0oC。利用Design-expert 8.0.6进行实验设计,生成17组实验。通过模型预测分析,得到的最佳包合条件为:尿素/脂肪酸2.3,95%乙醇/尿素4.7,温度1.1oC,EPA纯度及得率的预测值分别为57.0%和79.8%。在最佳包合条件下进行验证实验,EPA纯度及得率的实验结果分别为55.6%和80.4%,与预测值较为吻合,说明模型较好反映了尿素包合法纯化EPA的条件。
【关键词】:微拟球藻 光强 氮源种类 直接皂化提取 尿素包合
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q946
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-8
  • 第一章 绪论8-15
  • 1.1 微拟球藻及EPA功能概述8-9
  • 1.1.1 微拟球藻及其生化组成8
  • 1.1.2 EPA功能简介8-9
  • 1.2 微拟球藻生长及脂肪酸组成的影响因子9-10
  • 1.2.1 培养基成分的影响9
  • 1.2.2 培养环境的影响9-10
  • 1.3 微拟球藻EPA提取方法10-12
  • 1.3.1 机械破壁提油10-11
  • 1.3.2 溶剂萃取提油11
  • 1.3.3 超临界流体萃取提油11
  • 1.3.4 超声辅助提油11-12
  • 1.4 微拟球藻EPA纯化技术12-13
  • 1.4.1 低温结晶法12
  • 1.4.2 尿素包合法12
  • 1.4.3 酶酯化法12-13
  • 1.4.4 超临界色谱法13
  • 1.4.5 分子蒸馏法13
  • 1.5 研究意义与内容13-15
  • 1.5.1 立题意义13
  • 1.5.2 研究内容13-15
  • 第二章 材料与方法15-22
  • 2.1 实验材料与设备15-16
  • 2.1.2 仪器设备15
  • 2.1.3 实验材料15-16
  • 2.2 方法16-22
  • 2.2.1 光强影响实验16
  • 2.2.2 氮源种类影响实验16
  • 2.2.3 两阶段氮源补料时间优化实验16
  • 2.2.4 藻粉破壁方法16-17
  • 2.2.5 微拟球藻脂肪酸提取方法17
  • 2.2.6 尿素包合法纯化微拟球藻脂肪酸17
  • 2.2.7 分析方法17-22
  • 第三章 结果与讨论22-42
  • 3.1 微拟球藻EPA高效积累策略的研究22-29
  • 3.1.1 光强对微拟球藻生理生化及EPA代谢的影响22-24
  • 3.1.2 氮源种类对微拟球藻生理生化及EPA代谢的影响24-27
  • 3.1.3 两阶段氮源补料策略强化微拟球藻EPA积累27-29
  • 3.2 微拟球藻胞内EPA提取的研究29-32
  • 3.2.1 细胞破壁对EPA提取率的影响29-30
  • 3.2.2 不同提取方法操作参数比较30-31
  • 3.2.3 提取溶剂极性对EPA相对含量和脂肪酸组成的影响31-32
  • 3.3 尿素包合法纯化微拟球藻总脂肪酸中EPA研究32-42
  • 3.3.1 尿素包合法纯化EPA的单因素研究32-35
  • 3.3.2 尿素包合法纯化EPA的响应面研究35-42
  • 主要结论与展望42-44
  • 致谢44-45
  • 参考文献45-48
  • 附录 1: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文48-49
  • 附录 2: 混合脂肪酸标样气相数据49-50
  • 附录 3: 培养装置图与气相图谱50-52
  • 附录 4: 提取与纯化实验操作过程图52-53

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