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《江南大学》 2017年
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阪崎克罗诺肠杆菌类脂A磷酸乙醇胺转移酶相关基因的鉴定

刘璐  
【摘要】:阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种食源性革兰氏阴性条件致病菌,它主要污染婴儿配方奶粉,会引起菌血症、新生儿脑膜炎、败血症及坏死性小肠炎等多种疾病。类脂A分子位于革兰氏阴性细菌的外膜外层,对于细胞的稳定性、渗透性及细菌的致病性起着重要的作用,且其分子结构与细菌致病能力有关。在大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中存在eptA基因,它编码的磷酸乙醇胺转移酶可以修饰类脂A分子结构。本论文利用基因表达和染色体基因敲除技术,构建一系列Cronobacter sakazakii BAA894基因工程菌,实验确定了ESA_RS09200为C.sakazakii BAA894中编码磷酸乙醇胺转移酶的基因,并且对该基因在C.sakazakii BAA894致病能力中所起作用进行探究。本课题的主要研究结论如下:(1)实验发现C.sakazakii BAA894在低pH(pH 5.0)条件下,类脂A结构上发生磷酸乙醇胺的修饰。通过基因组同源比对,发现BAA894中两个基因ESA_RS09200和ESA_RS16425与E.coli和S.typhimurium中eptA基因的同源性很高。(2)将ESA_RS09200和ESA_RS16425在E.coli W3110和C.sakazakii BAA894中过量表达,在pH 5.0条件下生长,提取类脂A并进行结构鉴定,证明ESA_RS09200编码磷酸乙醇胺氨基转移酶,而ESA_RS16425编码的酶不能修饰类脂A。(3)在C.sakazakii BAA894中分别敲除ESA_RS09200和ESA_RS16425,构建了对应的突变菌株WLL001和WLL002。在pH 5.0条件下生长,提取类脂A并进行结构鉴定,进一步证明ESA_RS09200编码磷酸乙醇胺氨基转移酶,而ESA_RS16425编码的酶不能修饰类脂A。测定了WLL001突变株的一系列生物学特性,包括生长曲线、细胞表面疏水性、外膜渗透性及抗生素最小抑菌浓度,并与野生型菌株进行对比,研究外膜LPS结构改变后,菌株的生化表型情况。(4)通过构建BAA894/pWSK29-lpxE、WLL001/pWSK29-lpxE、WLL003/pWSK29-lpxE和WLL003/pWSK29-lpxF菌株,使类脂A分子1位上或4’位上的磷酸基团缺失,证明ESA_RS09200编码磷酸乙醇胺氨基转移酶只能对4’位的磷酸进行修饰。(5)通过WLL001突变株活菌体刺激HEK-Blue hTLR4细胞和提取纯化突变株的脂多糖分子来刺激小鼠RAW264.7细胞,分析了类脂A结构改变对免疫识别的影响。通过细胞侵染实验发现WLL001突变株对Caco-2细胞的侵染能力下降,在THP-1巨噬细胞内的存活率降低。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;R378

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