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《江南大学》 2017年
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细菌耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及发酵优化

刘强  
【摘要】:氨肽酶(Aminopeptidase,APs)是一类可以水解多肽链和蛋白质N端氨基酸的蛋白酶。它可以作为一种风味蛋白酶,去除蛋白水解液的苦味并同时提高水解液游离氨基酸含量,还可以用于医疗诊断和蛋白N端测序等。本文将铜绿假单胞菌NJ-814的一种耐热赖氨酸氨肽酶基因(plap)克隆并转化到毕赤酵母GS115染色体上,实现该基因的分泌表达,并进行重组菌的发酵条件优化、plap基因偏好优化、重组赖氨酸氨肽酶(PLAP)纯化、特性表征及应用研究。单因素实验优化重组毕赤酵母摇瓶条件,最优条件为:起始诱导时间为18h,诱导培养基初始pH为5.0、甲醇浓度1.5%、诱导温度28℃、装液量25mL/250mL、Co~(2+)浓度50μmol·mL~(-1)和山梨醇添加量9g·L~(-1)。最优条件下,上清液酶活达到3.02U·mL~(-1),氨肽酶酶活提高了5.21倍。根据密码子偏好性,优化和合成全基因序列,成功实现优化基因在毕赤酵母中的表达,优化后基因的表达水平与原始基因相比提高20.53%。在7 L发酵罐中对产赖氨酸氨肽酶重组毕赤酵母高密度发酵实验进行了摸索,初始诱导菌体量OD_(600)为400时开始诱导,诱导84 h后上清液中氨肽酶酶活达到最高,为7.8U·mL~(-1),是摇瓶产酶水平的2.14倍。重组赖氨酸氨肽酶经40%-60%盐析处理,Hitrap Q HP阴离子交换层析和Superdex~(TM)75 10/300GL凝胶过滤层析分离,最终纯化得到的氨肽酶比酶活为36.41 U·mg~(-1),回收率为4.79%,纯化倍数为3.95。对重组赖氨酸氨肽酶特性研究发现,该氨肽酶最适pH为9.0,在pH7.0-9.5之间稳定性良好。该氨肽酶最适反应温度为80℃,在50-70℃保留2h,残留活性在80%以上,具有良好的热稳定性。Ca~(2+)和Co~(2+)能够促进重组氨肽酶的活性,DTT、β-mercaptoethanol、Ni~(2+)及EDTA能够强烈抑制重组酶活性,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、PMSF、Mn~(2+)对重组赖氨酸氨肽酶的活性影响较小,Co~(2+)能够解除EDTA对氨肽酶的抑制作用。该氨肽酶水解Lys-pNA的能力最强,同时能水解Leu-pNA和Arg-pNA。糖基化位点分析表明赖氨酸氨肽酶存在3个潜在的糖基化位点,去糖基化酶处理前后酶的分子量变化说明该氨肽酶部分糖基化,糖基化对底物特异性和pH稳定性影响不大,但降低了该氨肽酶的温度稳定性。对重组赖氨酸氨肽酶的应用进行研究,考察碱性蛋白酶、赖氨酸氨肽酶以及双酶复配水解酪蛋白的效果。与不加酶的空白对照相比,三种溶液中的游离氨基酸均含量显著增加,分别为22.5倍、10.5倍和65倍。碱性蛋白酶与氨肽酶复配水解时,亮氨酸与赖氨酸含量最高,寡肽、小肽的含量明显增加,其中180 Da以下的小肽含量占到22.76%,2000 Da以上的大分子基本被降解。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;TQ925

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