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《江南大学》 2017年
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细菌耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及发酵优化

刘强  
【摘要】:氨肽酶(Aminopeptidase,APs)是一类可以水解多肽链和蛋白质N端氨基酸的蛋白酶。它可以作为一种风味蛋白酶,去除蛋白水解液的苦味并同时提高水解液游离氨基酸含量,还可以用于医疗诊断和蛋白N端测序等。本文将铜绿假单胞菌NJ-814的一种耐热赖氨酸氨肽酶基因(plap)克隆并转化到毕赤酵母GS115染色体上,实现该基因的分泌表达,并进行重组菌的发酵条件优化、plap基因偏好优化、重组赖氨酸氨肽酶(PLAP)纯化、特性表征及应用研究。单因素实验优化重组毕赤酵母摇瓶条件,最优条件为:起始诱导时间为18h,诱导培养基初始pH为5.0、甲醇浓度1.5%、诱导温度28℃、装液量25mL/250mL、Co~(2+)浓度50μmol·mL~(-1)和山梨醇添加量9g·L~(-1)。最优条件下,上清液酶活达到3.02U·mL~(-1),氨肽酶酶活提高了5.21倍。根据密码子偏好性,优化和合成全基因序列,成功实现优化基因在毕赤酵母中的表达,优化后基因的表达水平与原始基因相比提高20.53%。在7 L发酵罐中对产赖氨酸氨肽酶重组毕赤酵母高密度发酵实验进行了摸索,初始诱导菌体量OD_(600)为400时开始诱导,诱导84 h后上清液中氨肽酶酶活达到最高,为7.8U·mL~(-1),是摇瓶产酶水平的2.14倍。重组赖氨酸氨肽酶经40%-60%盐析处理,Hitrap Q HP阴离子交换层析和Superdex~(TM)75 10/300GL凝胶过滤层析分离,最终纯化得到的氨肽酶比酶活为36.41 U·mg~(-1),回收率为4.79%,纯化倍数为3.95。对重组赖氨酸氨肽酶特性研究发现,该氨肽酶最适pH为9.0,在pH7.0-9.5之间稳定性良好。该氨肽酶最适反应温度为80℃,在50-70℃保留2h,残留活性在80%以上,具有良好的热稳定性。Ca~(2+)和Co~(2+)能够促进重组氨肽酶的活性,DTT、β-mercaptoethanol、Ni~(2+)及EDTA能够强烈抑制重组酶活性,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、PMSF、Mn~(2+)对重组赖氨酸氨肽酶的活性影响较小,Co~(2+)能够解除EDTA对氨肽酶的抑制作用。该氨肽酶水解Lys-pNA的能力最强,同时能水解Leu-pNA和Arg-pNA。糖基化位点分析表明赖氨酸氨肽酶存在3个潜在的糖基化位点,去糖基化酶处理前后酶的分子量变化说明该氨肽酶部分糖基化,糖基化对底物特异性和pH稳定性影响不大,但降低了该氨肽酶的温度稳定性。对重组赖氨酸氨肽酶的应用进行研究,考察碱性蛋白酶、赖氨酸氨肽酶以及双酶复配水解酪蛋白的效果。与不加酶的空白对照相比,三种溶液中的游离氨基酸均含量显著增加,分别为22.5倍、10.5倍和65倍。碱性蛋白酶与氨肽酶复配水解时,亮氨酸与赖氨酸含量最高,寡肽、小肽的含量明显增加,其中180 Da以下的小肽含量占到22.76%,2000 Da以上的大分子基本被降解。
【关键词】:赖氨酸氨肽酶 毕赤酵母 分泌表达 发酵优化 酶学特性
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;TQ925
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-9
  • 第一章 绪论9-17
  • 1.1 氨肽酶概述9-11
  • 1.1.1 氨肽酶的来源9
  • 1.1.2 氨肽酶的分类9-10
  • 1.1.3 氨肽酶的应用10-11
  • 1.2 毕赤酵母表达系统概述11-13
  • 1.2.1 毕赤酵母表达系统的优缺点12
  • 1.2.2 毕赤酵母上罐工艺12-13
  • 1.3 密码子优化概述13-14
  • 1.3.1 密码子优化概述13
  • 1.3.2 毕赤酵母密码子偏好性及密码子优化应用13-14
  • 1.4 氨肽酶发展现状14-15
  • 1.4.1 国外研究现状14-15
  • 1.4.2 国内研究进展15
  • 1.5 立题意义15-16
  • 1.6 本论文研究内容16-17
  • 第二章 材料与方法17-27
  • 2.1 材料17-18
  • 2.1.1 菌株与质粒17
  • 2.1.2 主要仪器17
  • 2.1.3 培养基与溶液17-18
  • 2.1.4 主要试剂18
  • 2.2 实验方法18-23
  • 2.2.1 细菌质粒的提取18
  • 2.2.2 基因组的提取18
  • 2.2.3 目的基因的扩增18-19
  • 2.2.4 plap基因和质粒的双酶切19
  • 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备19
  • 2.2.6 重组质粒的连接19-20
  • 2.2.7 连接产物转化感受态细胞20
  • 2.2.8 转化子的菌落PCR验证20
  • 2.2.9 重组质粒的双酶切验证20
  • 2.2.10 重组质粒的DNA测序20
  • 2.2.11 重组载体pPIC9K-plap的线性化20
  • 2.2.12 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备20-21
  • 2.2.13 电转化毕赤酵母GS11521
  • 2.2.14 重组酵母的筛选21
  • 2.2.15 重组毕赤酵母的表达21-22
  • 2.2.16 重组毕赤酵母产赖氨酸氨肽酶的发酵优化22-23
  • 2.3 密码子优化23
  • 2.3.1 密码子优化方案23
  • 2.3.2 密码子优化结果验证23
  • 2.4 分析方法23-27
  • 2.4.1 酵母生长曲线的测定23
  • 2.4.2 菌体湿重的测定23
  • 2.4.3 赖氨酸氨肽酶酶活的测定23
  • 2.4.4 蛋白浓度的测定23-24
  • 2.4.5 赖氨酸氨肽酶的分离纯化24-25
  • 2.4.6 SDS-PAGE分析25
  • 2.4.7 重组酶的去糖基化分析25
  • 2.4.8 MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析25
  • 2.4.9 重组赖氨酸氨肽酶的酶学性质研究25-26
  • 2.4.10 重组赖氨酸氨肽酶的复配应用初探26-27
  • 第三章 结果与讨论27-48
  • 3.1 重组赖氨酸氨肽酶菌株毕赤酵母构建与表达27-30
  • 3.1.1 pPIC9K-plap的构建27-28
  • 3.1.2 产赖氨酸氨肽酶菌株的筛选28-29
  • 3.1.3 重组毕赤酵母的表达验证29
  • 3.1.4 重组酵母赖氨酸氨肽酶表达验证29-30
  • 3.2 重组毕赤酵母产酶的摇瓶发酵优化30-34
  • 3.2.1 重组菌的生长曲线30
  • 3.2.2 诱导开始时间对重组菌产酶的影响30-31
  • 3.2.3 初始pH对重组菌产酶的影响31
  • 3.2.4 诱导温度对重组菌产酶的影响31-32
  • 3.2.5 甲醇浓度对重组菌产酶的影响32-33
  • 3.2.6 装液量对重组菌产酶的影响33
  • 3.2.7 Co~(2+)对重组菌产酶的影响33-34
  • 3.2.8 山梨醇添加量对重组毕赤酵母产氨肽酶的影响34
  • 3.3 密码子偏好优化赖氨酸氨肽酶及验证34-37
  • 3.3.1 赖氨酸氨肽酶基因序列的优化设计34-35
  • 3.3.2 plap基因密码子优化结果35-36
  • 3.3.3 密码子优化结果的验证36-37
  • 3.4 重组酶在7L发酵罐上的表达37-38
  • 3.4.1 甘油补料发酵37-38
  • 3.4.2 甲醇补料发酵38
  • 3.5 重组赖氨酸氨肽酶分离纯化38-42
  • 3.5.1 硫酸铵盐析38-39
  • 3.5.2 Hitrap Q HP阴离子交换层析39
  • 3.5.3 Superdex~(TM) 7510/300GL凝胶过滤层析39-40
  • 3.5.4 氨肽酶分离结果及分析40
  • 3.5.5 重组赖氨酸氨肽酶糖基化分析40-41
  • 3.5.6 MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析41-42
  • 3.6 重组赖氨酸氨肽酶的酶学性质42-46
  • 3.6.1 重组氨肽酶的最适pH及pH稳定性42
  • 3.6.2 重组氨肽酶最适反应温度和温度稳定性42-43
  • 3.6.3 金属离子和蛋白酶抑制剂对重组氨肽酶的影响43-44
  • 3.6.4 重组氨肽酶的底物特异性44-45
  • 3.6.5 重组酶动力学常数分析45-46
  • 3.7 重组氨肽酶的应用初探46-48
  • 3.7.1 氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解酪蛋白46-48
  • 主要结论与展望48-50
  • 主要结论48-49
  • 展望49-50
  • 致谢50-51
  • 参考文献51-55
  • 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文55-56
  • 标准曲线56-58

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