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《江南大学》 2018年
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解纤维梭菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达、应用及固定化研究

孙帆  
【摘要】:D-阿洛酮糖甜度是蔗糖的70%,但是几乎不含有热量,可应用于食品、医药、保健品等领域。酶法制备D-阿洛酮糖具有专一高效、反应条件温和等优势,逐渐用于大规模的工业化生产。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,简称DPEase)可专一催化D-果糖C3位置差向异构化生成D-阿洛酮糖。解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum H10)来源的DPEase具有较好的热稳定性和催化效率。本研究首先将该DPEase在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中重组表达,并进行了酶学性质的研究。接着通过摇瓶和3-L罐发酵优化实现了DPEase的高效表达。最后进一步研究了重组酶制备D-阿洛酮糖以及重组菌的固定化,为工业化生产奠定了基础。主要研究结果如下:(1)构建了重组菌B.subtilis/pHY300PLK-P_(amyQ)-dpe和B.subtilis/pHY300PLK-P_(hpaΙΙ)-P_(amyQ)-dpe,重组菌在摇瓶中培养48 h后,胞内酶活分别达到149.2 U·mL~(-1)和147.5U·mL~(-1),蛋白电泳显示在33 kDa处出现目的条带,表明来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPEase在B.subtilis中成功表达。进一步考察了重组DPEase的酶学性质。结果表明,重组酶的最适p H为7.5,最适温度为65℃;在pH 7.5和0.1 m M Co~(2+)条件下,其55℃和60℃的半衰期分别为3 h和0.5 h;重组全细胞在4℃的储藏效果较好,15天后残余酶活为82%。(2)为了提高重组酶的表达量,首先在摇瓶中考察了培养基组分对重组菌产DPEase的影响,结果表明:最适培养基组成为大豆蛋白胨20 g·L~(-1)、玉米浆15 g·L~(-1)、甘油5 g·L~(-1)、1 mM Ca~(2+)、K_2HPO_4 12.54 g·L~(-1)、KH_2PO_4 2.31 g·L~(-1),此时DPEase的酶活力达到314.3U·mL~(-1);进一步在3-L罐中考察了不同补料C/N、发酵pH和温度对DPEase表达量的影响,结果表明发酵最适补料C/N为1:2、pH为7.0、温度33℃,酶活力最终达2246.3 U·mL~(-1),是摇瓶优化前的15倍;最后我们对重组DPEase的启动子P_(amyQ)进行定点突变,有效的缓解了由于碳源浓度过高引起的蛋白转录阻遏效应,重组菌突变体B.subtilis/pHY300PLK-P_(amyQ)/G212A-dpe在3-L罐中利用高浓度碳源时DPEase酶活力从495.4 U·m L~(-1)提高到1030.6 U·mL~(-1),由于利用高浓度碳源进行发酵时周期短,且生产成本低,具有一定的工业应用价值。(3)考察了不同反应条件对重组DPEase制备D-阿洛酮糖的影响。确定了最适的酶转化条件如下:反应pH为7.5,反应温度为60℃,加酶量为30 U·g~(-1)底物,反应4 h,300 g·L~(-1)果糖为底物时转化率最高达28.17%;本研究进一步对重组菌全细胞催化生产D-阿洛酮糖的转化工艺进行了优化,当以300 g·L~(-1)果糖作为底物,在反应体系中添加终浓度为10 g·L~(-1)的全细胞,在pH 7.5,65℃下反应1 h,转化率可达27.48%。(4)采用海藻酸钠-硅藻土(吸附-包埋法)对重组菌全细胞进行固定化研究,得到最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度为2%(m/v),细胞包埋量为50 g·L~(-1)(m/v),Ca Cl_2浓度为2%(m/v),硅藻土浓度为10 g·L~(-1)(m/v),在此条件下固定化细胞酶活回收率最高,可达64%。固定化细胞与游离全细胞相比最适pH不变,均为8.0,而最适温度提高了5℃,为70℃。在利用固定化细胞催化生产D-阿洛酮糖时,55℃下重复操作7个批次后,转化率仍保持在28%左右,同时仍保留81%的残留酶活。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ925;Q814.2

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