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《江南大学》 2018年
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脯氨酸氨肽酶在枯草芽孢杆菌中表达、发酵优化及应用

王开道  
【摘要】:脯氨酸氨肽酶(PAP;E.C.3.4.11.5)是一种能特异地水解蛋白质或多肽N端脯氨酸残基的外肽酶,其在食品蛋白质水解脱苦、生物活性肽制备方面有着重要应用,同时在生物医药、检测方面的应用前景潜力巨大。本论文将来源于米曲霉的脯氨酸氨肽酶cDNA为模板,成功构建了产带有组氨酸标签的脯氨酸氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌。培养基经单因素及正交实验获得优化组合:酵母膏60 g·L~(-1),葡萄糖20 g·L~(-1),鱼粉蛋白胨18.75 g·L~(-1),NH_4Cl 6.25 g·L~(-1),KH_2PO_4 2.31 g·L~(-1),K_2HPO_4 12.54 g·L~(-1)。优化后PAP总酶活达到103.1 U·mL~(-1)。添加0.1%的植酸到培养基中PAP总酶活提高到111.1U·m L~(-1)。摇瓶培养条件优化为初始pH 7.0、4%接种量、50 mL装液量及培养温度33℃,220 r·min~(-1),培养24 h。添加0.5 mmol·L~(-1)SDS和0.2%曲拉通-100到优化的培养基中,胞外酶活可从原来的8.4 U·mL~(-1)提高到31.3 U·mL~(-1),总酶活变化不大为116.8 U·m L~(-1)。基于不同搅拌转速、发酵pH、发酵温度下发酵动力学分析,得到5 L发酵罐优化的发酵条件:转速的调控为0~6 h 200 r·min~(-1),6~12 h和28 h后400 r·min~(-1),12~28 h为500 r·min~(-1);pH的调控为0~12 h不控制pH,12~16 h为pH 7.0,16~28 h pH不控制,28h后pH 7.0;温度的调控为40℃发酵前8 h,8~12 h为35℃,12 h至发酵结束为33℃。在此条件下,PAP总酶活达到174.8 U·mL~(-1),其中胞外酶活为52.6 U·m L~(-1)。在分批发酵优化条件下,发酵12 h后进行补料,间隔4 h流加葡萄糖,重复8次,使发酵液中还原糖浓度达15g·L~(-1),在此条件下,PAP总酶活最高达227.1 U·mL~(-1),其中胞外酶活为73.6U·m L~(-1)。胞外PAP经过30%~50%硫酸铵盐析、透析、Ni~(2+)亲和层析纯化后,比酶活达115.8U·mg~(-1),纯化倍数和回收率分别为3.6倍、38.0%。重组菌细胞经过溶菌酶和反复冻融进行破碎处理,裂解液经Ni~(2+)亲和层析,PAP比酶活达135.3 U·mg~(-1),纯化倍数和回收率分别为3.9倍、27.2%。胞内外纯化的PAP经鉴定均已达电泳纯,酶学性质较之前没加组氨酸标签时基本不变。添加3%蔗糖、3%甘露醇、1%甘氨酸作为冻干保护剂,PAP在冻干过程中的稳定性显著增强,冻干后酶活性基本不变。冻干酶在-20℃放置6个月,酶活残留率仍保持在90%以上,储存稳定性显著提升。PAP与碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶协同水解大米蛋白,水解液中游离氨基酸显著增加,其中疏水性氨基酸含量大幅度增加有助于水解液苦味的减轻。水解液中亲水性多肽含量增加,多肽分子量主要集中1kDa以下,其中180 Da以下的小肽占到了44.7%。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ925

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