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重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的研究

王秀婷  
【摘要】:苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸,它能够抑制多种食源性致病菌。大量研究表明苯乳酸是一种广谱抗菌物质,且抑菌活性强于一些常用的化学食品防腐剂,因此有望成为食品领域中一种新型生物防腐剂。早期研究中,主要是利用微生物的代谢生产PLA,这种生产方法存在生产周期长、发酵产物不均一、产量低等缺点,因此,近几年人们将研究方向转移到了生物催化法制备PLA,虽然取得了一定的成果,但仍然存在以下不足之处:(1)多以价格昂贵的苯丙酮酸(PPA)为底物,不利于大规模工业化生产;(2)现有研究中,苯乳酸合成过程中所用的酶催化效率低,导致PLA转化率和产量低;(3)乳酸脱氢酶催化过程中需要不断消耗体系中的NADH,NADH价格也很昂贵,额外添加会使成本显著增加。为了解决以上问题,本研究通过共表达L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)、乳酸脱氢酶(LDH)和甲酸脱氢酶(FDH),构建了高产PLA的重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh_(10)-fdh),它可以利用价格更便宜的苯丙氨酸(Phe)为底物,高效转化生产PLA。首先克隆了来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD三点突变体D165K/F263M/L336M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。然后利用生物信息学技术,在GenBank数据库中筛选获得了10种不同来源、具有一定序列差异的编码乳酸脱氢酶的基因。为了在10种基因中选择出活性最高的一种,我们将L-AAD分别与获得的乳酸脱氢酶共表达,构建了10株重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh),通过比较10种LDH的蛋白表达量和10株重组大肠杆菌产PLA的能力,选择出了活性最高的乳酸脱氢酶,即来源于Lactobacillus sp.CGMCC 9967的LDH_(10)作为后续的研究对象。为了构建一种副产物少、更加稳定的辅酶NADH再生系统,本文选择了来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidini)的CbFDH再生辅酶NADH,首先采用酶偶联的方法将LDH_(10)和FDH融合表达,然后与L-AAD共表达,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh),经IPTG诱导后,L-AAD、LDH_(10)和FDH均在大肠杆菌中成功表达。为了使重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh_(10)-fdh)更加高效利用Phe合成PLA,本文对乳酸脱氢酶基因ldh_(10)前的RBS序列进行了优化,最佳RBS序列为5’-TTAATAAGGAGATATA-3’。并在摇瓶水平上对重组大肠杆菌BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)的发酵条件和全细胞转化条件进行了优化,确定发酵条件为:种龄为9 h,接种量为4%,IPTG诱导剂浓度为0.4 mmol?L~(-1),诱导温度和时间为25~oC诱导10 h;确定全细胞催化条件为:转化体系pH为7.0,温度为37~oC,共底物甲酸铵的添加量为Phe的2倍摩尔当量,底物Phe与全细胞催化剂的添加比例为4:3(g?L~(-1)),当底物Phe浓度大于等于30 g?L~(-1),需添加90 mmol?L~(-1)葡萄糖。在上述条件下,重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh_(10)-fdh)最高可以转化Phe合成30 g?L~(-1)PLA,转化率为100%,时空产率为48.48 g?L~(-1)?d~(-1)。最后,本文研究了重组大肠杆菌BL21(DE3)(p RSF-aad-ldh_(10)-fdh)的稳定性,发现连续传代三次后,合成的PLA产量只下降了3.25%,质粒保有率为99%,传代5次后,PLA产量下降了5.40%,符合工程菌应用于工业生产的要求。


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