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《江南大学》 2018年
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蛹虫草多糖和虫草素的提取分离及活性研究

江琦  
【摘要】:蛹虫草[Cordyceps militaris(L.ex Fr)Link]是一类可与冬虫夏草媲美的食药两用真菌,具有抗氧化、调节免疫、抑菌和抗癌等作用。它含有蛹虫草多糖和虫草素两种主要的活性物质。本文首先优化蛹虫草多糖的提取分离工艺,然后对其化学组成、结构信息进行初步表征,并且评价蛹虫草多糖的抗氧化活性;同时分离纯化蛹虫草虫草素,考察其抑菌效果,首次探讨虫草素的抑菌作用机制,为蛹虫草功能物质的深度开发提供理论基础。主要研究和结果如下:1.虫草粗多糖(CMP)的提取。在微波辅助条件下,采用聚乙二醇(PEG)提取虫草粗多糖,借助响应面优化得到最佳提取条件为:PEG200浓度21%、微波功率360 W和提取时间8 min,CMP提取率达93.2%,比水提取CMP提取率提高21.9%。扫描电镜(SEM)观察结果表明:微波辅助PEG200提取后,虫草子实体的组织表面明显破裂。紫外光谱和红外光谱分析表明:两种方法提取的多糖具有相似的特征吸收峰。热分析实验表明两种多糖也具有良好的热稳定性。2.虫草粗多糖的分离。经DEAE-52水洗得到中性虫草多糖(CMP-1),在260 nm和280 nm处CMP-1均无明显紫外吸收,纯度为76.6%,比脱蛋白脱色处理的粗多糖纯度(45.0%)提高70%。红外光谱结果表明:CMP-1为α-构型糖苷键组成的多糖。通过气质联用(GC-MS)技术得到单糖组成为甘露糖、半乳糖和葡萄糖,对应单糖摩尔比为1.0:1.5:3.9;应用多角度激光光散射凝胶色谱联用示差(GPC-MALLS-RI)技术测定CMP-1的重均分子量(M_W)为2.432×10~7 g/mol,均方根旋转半径(Rg)为31 nm,并且CMP-1在溶液状态下为高枝化度结构。抗氧化实验结果发现蛹虫草多糖清除DPPH和ABTS自由基的IC_(50)值分别为0.8 mg/mL和1.4 mg/m L,具有良好的抗氧化活性。3.虫草素的分离纯化。经高效液相色谱法测定,蛹虫草子实体虫草素含量为0.56%。应用NKA-II大孔树脂和Sephadex G-10柱层析技术分离纯化的虫草素纯度达98.8%。经超高效液相-飞行时间-质谱联用(UPLC-TOF-MS)分析鉴定,母离子m/z 252[M+H]~+和二级碎片离子m/z 136[M+H]~+均与虫草素标准品一致,即所纯化的物质为虫草素。4.虫草素的抑菌效果及其抑菌机理研究。经最低抑菌浓度(MIC)抑菌实验证明:虫草素能够有效抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长,尤其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑菌效果作用明显,MIC分别为2.50 mg/m L和1.25 mg/mL。扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)结果表明:虫草素可以破坏细菌细胞膜和细胞壁;核酸泄露实验发现:细菌表面细胞膜透透性增大,细胞内溶物渗漏。碘化丙啶(PI)和羧基二乙酸荧光素(cFDA)双染法联合流式细胞术(FCM)分析也发现,细菌细胞膜在30 min内受到严重破坏,但细胞内酶系统仍具有活性,这进一步表明膜损伤是虫草素杀死细菌的主要原因之一。此外,紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱分析结果表明:虫草素即可与细菌DNA的疏水性碱基发生嵌插结合,也可与DNA的磷酸基团发生静电结合作用,进而影响细菌DNA的复制、转录和表达。由此说明,破坏细胞壁膜、改变细菌DNA结构均是导致大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等死亡的重要原因。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS219

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