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《江南大学》 2018年
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重组酪氨酸脱羧酶的可溶性表达及合成酪胺的研究

姜明扬  
【摘要】:酪胺及其衍生物是合成具有多种生理药理学活性成分的重要中间体,广泛应用于药品、保健品和化妆品行业。酪氨酸脱羧酶(Tyrosine decarboxylase,Tyr DC)可以催化酪氨酸的羧基去除反应生成酪胺。利用Tyr DC合成酪胺工艺简单、效率高、绿色环保,是具有巨大潜力的酪胺合成途径之一。本研究对短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源Tyr DC重组表达的包涵体问题进行探究发现:(1)向LB培养基中添加葡萄糖、果糖、阿拉伯糖和甘露糖能够有效提高重组Tyr DC可溶性表达水平;(2)重组Tyr DC的可溶性表达和包涵体形成是相对独立的,酸性p H能够促进其可溶性表达,而葡萄糖、果糖或阿拉伯糖对减少包涵体不可或缺;基于以上结果,通过向LB培养基中添加葡萄糖(10 g·L–1,LBG培养基)和控制p H 6.50–6.80的策略获得的可溶性Tyr DC,与在LB培养基中仅控制p H 6.50–6.80的策略相比,Tyr DC在LBG和LB中的发酵液酶活力分别为30.70和22.00 k U·L–1,提高了1.40倍;其冻干酶粉的活力分别是46.30和12.60 U·mg–1,提高了3.67倍。以酪氨酸为底物,利用Tyr DC酶粉进行酪胺合成。对反应缓冲体系及p H、温度、表面活性剂等反应条件进行优化,结果如下:该反应的最适缓冲体系是Na2HPO4-KH2PO4,最适反应p H是5.50,最适反应温度为40℃,最佳表面活性剂是Tween 80。当底物浓度为100 mmol·L?1时,20 h底物完全转化所需的酶量为0.125 g·L–1,底物与催化剂用量的比例(S/C)为145 g·g–1,总转换化数(TTN)是116,000;当底物浓度增加到200 mmol·L?1时,添加0.50 g·L–1 Tyr DC酶粉,反应24 h底物转化率达99.90%以上,此时S/C和TTN分别是72.50 g·g–1和58,200;当底物浓度增加到400 mmol·L?1时,24 h时转化率超过99.99%需要添加2.50 g·L–1Tyr DC酶粉,此时S/C和TTN分别是29 g·g–1和23,300。通过丙氨酸扫描策略对L-Tyr DC进行分子改造,获得了对D-酪氨酸活力提高的5个有益位点,分别是M99、S101、Y331、Y395及S586,其中S101A突变体对D-酪氨酸的活力是野生型Tyr DC的2.06倍,双突变体M99A/S586A的活力是野生型Tyr DC的2.73倍。对S101A和M99A/S586A突变体进行蛋白纯化,纯酶对D-酪氨酸比活力分别是0.98和1.45 U·g–1。综上所述,利用高可溶性表达的重组Tyr DC可以绿色、高效合成酪胺,为生物法合成酪胺提供了高效催化剂;通过丙氨酸扫描发现对D-酪氨酸活力提高的5个关键位点,为Tyr DC的分子改造提供突变热点以及构建级联反应合成手性氨基醇奠定理论基础。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ925;Q55

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