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《江南大学》 2018年
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发酵乳杆菌中D-乳酸脱氢酶的克隆鉴定及其应用研究

陈丽霞  
【摘要】:苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是广泛存在于蜂蜜和酸奶、酸面团、泡菜、干酪等发酵食品中的一种天然小分子有机酸。因其安全性高、稳定性佳、抑菌谱宽,溶解性好而被认为是一种新型的天然生物防腐剂。PLA在食品、医药、化妆品等方面都具有广阔的应用前景。本论文对Lactobacillus fermentum中的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)进行克隆表达及其酶学性质的研究,并构建D-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)的共表达菌株,实现辅酶再生,同时,对其全细胞合成D-PLA的条件进行了初步探究。主要研究结果如下:(1)从实验室保藏的20株乳酸菌中筛选得到一株D-苯乳酸产量较强的乳酸菌Lactobacillus fermentum JN248。(2)通过全基因组分析预测,成功克隆4个来自于Lactobacillus fermentum JN248的D-乳酸脱氢酶基因,它们分别为:lf-d-ldh0171(972 bp),lf-d-ldh0031(993 bp),lf-d-ldh0653(999 bp)和lf-d-ldh0940(1179 bp)。构建成功的重组大肠杆菌经诱导表达、酶活力检测,发现4个D-LDHs都具有活性,蛋白分子量分别约为:34.48 kDa,35.99 kDa,36.74kDa,43.08 kDa。通过酶活力验证及比较获得1个重组蛋白(LF-D-LDH0653),其苯丙酮酸还原能力最强。(3)对LF-D-LDH0653的诱导条件进行了优化,得到:当菌体浓度OD_(600)达到0.4时,添加IPTG使其终浓度达到0.3 mmol·L~(-1)为最佳诱导条件。利用镍柱和脱盐柱对LF-D-LDH0653进行纯化,并对酶学性质进行研究:其最适温度为50℃,最适pH为8.0。在较高温度及弱碱性条件下仍能保持较高活性。对丙酮酸、苯丙酮酸的催化作用最强。以苯丙酮酸为底物K_m,k_(cat)和k_(cat)/K_m分别为1.68 mmol·L~(-1),122.66 s~(-1)和73.01 L·mmol~(-1)·s~(-1)。(4)成功克隆来自Bacillus subtilis ATCC 13952中的gdh基因(786 bp),对应蛋白分子量28.16 kDa。并构建E.coli BL21(DE3)/pColdⅡ-ldh-gdh双酶共表达大肠杆菌,实现了辅酶再生。进一步优化了全细胞合成D-PLA的条件:20 mmol·L~(-1)磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 8.0),84 mmol·L~(-1)的葡萄糖,1.5 g·L~(-1)全细胞催化剂,60 mmol·L~(-1) PPA,45℃,200 r·min~(-1)反应3 h,转化率为94.7%。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.3

【参考文献】
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