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不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析

王雪山  
【摘要】:中国白酒的酿造过程是个复杂的自然多菌种固态发酵过程,在从谷物原料到白酒的发酵历程中,不仅涉及到酒曲中的微生物,同样集成了多种环境中的复杂微生物种群。因此,白酒发酵微生态应包含发酵过程微生态与发酵环境微生态。然而目前对于发酵环境微生物种群结构及其对发酵过程的影响尚且没有系统的研究。本研究选择典型的清香类型白酒生产过程,利用相同的大曲和发酵工艺,在老厂区及新厂区两个不同环境中同时进行两批比较性发酵研究,结合多相代谢物靶标分析、高通量测序和微生物溯源分析方法,系统分析了清香类型白酒发酵环境微生物组成结构、白酒发酵微生物的来源及环境微生物变化对白酒发酵的影响。此外,由于大曲的制作工艺同样是自发式固态发酵过程,因此本研究进一步分析了环境微生物对大曲微生物种群结构的影响。主要研究内容如下:(1)采用多相代谢物靶标分析不同酿造环境下酒醅中微生物代谢规律,发现环境改变会导致酒醅风味物质代谢图谱发生变化。从酒醅中共检测到58种代谢物,包括4种醇类、10种酸类、27种酯类、11种芳香族化合物和6种其他物质。通过对老厂区及新厂区两个典型酿造环境下的白酒发酵过程研究,发现新厂区酒醅与老厂区酒醅的代谢图谱有明显差异,主要体现在发酵结束时老厂区酒醅中乙醇含量(99.97±13.05 g?kg~(-1)酒醅)显著(p0.01)高于新厂区酒醅中乙醇含量(37.57±3.44 g?kg~(-1)酒醅),同时老厂区酒醅中总酯、总醇、总芳香族化合物含量均高于新厂区。但是新厂区酒醅中总酸含量高于老厂区,主要包含乙酸、乳酸和苹果酸。(2)通过高通量测序技术比较新厂区酒醅及老厂区酒醅中微生物种群演替规律,发现不同环境酒醅初始微生物种群结构不同,进一步造成酒醅中微生物演替规律及代谢的差异。结果显示酒醅中主要微生物包含6个细菌属和7个真菌属,细菌种群主要包含乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Kroppenstedtia、魏斯氏菌属(Weissella)和不动杆菌属(Acinetobacter),真菌种群主要包含毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、Kazachstania、复膜酵母属(Saccharomycopsis)、酵母属(Saccharomyces)、维克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和曲霉属(Aspergillus)。其中老厂区发酵初始酒醅中芽孢杆菌属(20.78±1.08%)、魏斯氏菌属(16.64±8.53%)、毕赤酵母属(55.10±12.37%)、维克汉姆酵母属(3.35±0.35%)和曲霉属(10.66±2.63%)相对丰度显著高于新厂区;而新厂区中假单胞菌属(17.04±11.27%)、不动杆菌属(3.02±0.69%)、假丝酵母属(16.47±4.31%)和Kazachstania(1.31±0.76%)相对丰度显著高于老厂区。发酵4 d之后,两个厂区酒醅细菌种群均逐渐演替为乳杆菌属(68.89~97.72%)。然而两个厂区酒醅中真菌种群产生较大差异,新厂区中主要真菌种群是假丝酵母属(43.32~74.13%),而老厂区则是毕赤酵母属(18.87~65.34%)成为主要真菌种群。同时,典范对应分析和Pearson相关性分析进一步表明假丝酵母属、Kazachstania和酒醅中酸类物质代谢呈正相关关系,和酯类代谢呈负相关关系,说明酒醅中微生物种群结构差异是酒醅代谢图谱发生变化的主要原因。(3)通过高通量测序解析白酒发酵环境中微生物种群结构时发现老厂区环境中白酒发酵功能微生物相对丰度高于新厂区。其中酿酒车间室内地面及工具富集了丰富的白酒酿造功能微生物,细菌种群主要包括乳杆菌属、芽孢杆菌属和魏斯氏菌属,真菌种群主要包括毕赤酵母属、复膜酵母属、酵母属、维克汉姆酵母属和曲霉属。采用原位模拟发酵的方法,设置两批不添加大曲的白酒发酵过程试验以验证环境微生物对白酒发酵过程的影响。结果表明新、老两个厂区不添加大曲的酒醅中芽孢杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和假丝酵母属的分布规律与相应正常发酵体系中的规律一致,这进一步表明环境微生物的改变会驱动白酒发酵过程微生物的演替及代谢规律。(4)通过SourceTracker定量分析白酒发酵微生物的来源,并结合可培养验证方式找出导致两个环境微生物种群结构差异的主要原因。结果表明白酒发酵过程中细菌种群主要来自发酵环境(主要是工具和未知环境,72.61~90.90%),包括乳杆菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属和Kroppenstedtia。发酵后期酒醅中主要细菌耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)全部来自环境。白酒发酵过程中真菌种群主要来自大曲(61.06~80.00%),主要贡献两个厂区酒醅中毕赤酵母属、复膜酵母属和曲霉属真菌。但是新厂区中优势真菌种群假丝酵母属主要来自工具。而且我们发现新厂区发酵环境中(工具)芽孢杆菌属的缺失是导致环境中假丝酵母属大量增殖的主要原因。(5)本研究进一步通过高通量测序及微生物溯源方法解析大曲微生物的来源。通过高通量测序在大曲及其制作环境中共检测到245个细菌属和119个真菌属。其中新曲细菌种群结构与原料相似度最高,真菌种群与室内地面及工具最接近。大曲制作过程中优势细菌种群由α-变形菌纲及γ-变形菌纲演替为芽孢菌纲,优势真菌种群由酵母纲、接合菌纲、伞型束梗孢菌纲和散囊菌纲演替为酵母纲和接合菌纲。通过SourceTracker定量分析原料及环境对大曲微生物种群的贡献,发现新曲中细菌种群主要来自制曲原料(小麦,82.67%),如成团泛菌(Pantoea agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas desiccabilis)等。但是成品曲中部分优势细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)主要来自室内地面和工具。同时制曲工具(55.18%)与室内地面(15.97%)也是大曲真菌种群的主要来源,如扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、梗孢酵母(Sterigmatomyces elviae)、(米/黄)曲霉(Aspergillus flavus/oryzae)、生丝毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)和横梗霉(Lichtheimia corymbifera)等。


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