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《江南大学》 2018年
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中心代谢优化促进枯草芽孢杆菌积累N-乙酰氨基葡萄糖

马文龙  
【摘要】:N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)及其衍生物氨基葡萄糖、N-乙酰神经氨酸在药品和保健品领域有着广泛的应用,以维持骨关节健康、增强免疫力;另外GlcNAc作为药物辅料,由于其溶解性好,安全性高,无副作用,可用于肿瘤诊断,促进药物吸收。本论文以重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)BSGN5为研究出发菌株,通过文献检索,借助高效液相色谱技术、核磁共振技术和质谱技术,深入分析GlcNAc合成、中心碳代谢溢流及中心氮代谢平衡之间的关系,利用代谢工程和途径酶工程,阻断中心碳代谢溢流、强化GlcNAc合成途径及前体供应,从而提高底物转化率,促进复合培养基中GlcNAc的积累;继而通过中心氮代谢优化,平衡胞内氧化还原水平,促进合成培养基中细胞生长和GlcNAc合成,为利用合成培养基发酵生产GlcNAc,降低生产成本奠定了一定基础。研究结果总结如下:(1)逐步阻断中心碳代谢溢流,将碳代谢流推向GlcNAc合成途径。敲除乙偶姻合成途径中局部转录调控因子AlsR、乙酰乳酸合成酶AlsS和乙酰乳酸脱羧酶AlsD编码基因,阻断副产物乙偶姻溢流后,采用复合培养基在3-L发酵罐中通过恒pH补料分批发酵,GlcNAc产量提升至48.9 g/L,产率提高到0.32 g/g葡萄糖;阻断乙偶姻溢流后发现未知酸性副产物积累,在摇瓶发酵中该未知酸性物质的积累严重抑制细胞生长和GlcNAc合成,进而通过文献检索结合高效液相色谱、核磁共振和质谱技术,确定阻断副产物乙偶姻合成后发酵液中溢流的酸性物质为乙酸,含量为6.0 g/L;继续敲除乙酸合成途径中的磷酸转乙酰基酶Pta和乙酸激酶AckA编码基因,阻断副产物乙酸溢流后,发现胞外丙酮酸积累,含量为6.0 g/L;由于丙酮酸是由果糖-6磷酸经糖酵解途径产生的,而GlcNAc合成途径与糖酵解途径竞争性消耗果糖-6磷酸,可减少丙酮酸的生成,而且GlcNAc合成消耗乙酰CoA,可以促进丙酮酸转化为乙酰CoA,从而促进丙酮酸的利用,所以丙酮酸的积累说明GlcNAc合成途径不够强,这为后续代谢工程改造提供了新的靶点。(2)采用mRNA 5’末端融合工程,强化GlcNAc合成途径关键酶CeGNA1和EcGlmS的表达,将碳代谢流拉向GlcNAc合成途径,减少丙酮酸的生成,促进GlcNAc积累。通过在关键酶CeGNA1的N端融合标签cMyc以及协同RBS优化,改变其mRNA 5’末端序列组成及形成的二级结构,强化CeGNA1的表达,将其蛋白表达量提高了90.8%,酶活提高到871.0 U/mg,促进了丙酮酸的利用和GlcNAc积累,复合培养基中摇瓶发酵,GlcNAc产量提高到11.9 g/L,产率为0.23 g/g葡萄糖;通过整合表达大肠杆菌来源的关键酶果糖-6-磷酸氨基转移酶Ec GlmS,并在其编码基因mRNA 5’末端添加mRNA稳定子△ermC+14/7A,改变mRNA 5’末端序列组成及形成的二级结构,将其转录水平提高了41%-56%,强化了EcGlmS的表达,与糖酵解途径竞争前体果糖-6磷酸,最终丙酮酸最大积累量降低到3.2 g/L,并在发酵24小时内被全部利用,复合培养基中摇瓶发酵,GlcNAc产量进一步提高到18.5 g/L,产率为0.37 g/g葡萄糖。(3)通过基于易错PCR的关键酶CeGNA1在丙酮酸压力下的定向进化协同异源脲酶调控表达,提高关键酶CeGNA1在丙酮酸压力下催化性能,改善重组细胞工厂丙酮酸压力下的生长,促进GlcNAc的积累。首先基于易错PCR的关键酶CeGNA1丙酮酸压力下定向进化,筛选得到突变体CeGNA1-Q155V/C158G,其催化效率提高了27.5%,达到1.25 s~(-1)uM~(-1),复合培养基中摇瓶发酵,GlcNAc产量提高到20.6 g/L,产率为0.41 g/g葡萄糖;然后选用时期特异性启动子P_(hag)调控脲酶表达,通过尿素的可控利用,缓控胞内pH,使得胞内最低pH由6.0升高到6.8,更有利于细胞生长和CeGNA1活性提高,复合培养基中摇瓶发酵,GlcNAc产量为25.6 g/L,产率为0.51 g/g葡萄糖;最后采用复合培养基在3-L发酵罐通过恒pH补料分批发酵,GlcNAc产量提高到82.5 g/L,产率为0.39 g/g葡萄糖。(4)虽然复合培养基中GlcNAc产量已经达到较高水平,但是复合培养基较高的成本限制了GlcNAc的工业化生产,构建一株可在合成培养基中生长良好并大量积累GlcNAc的枯草芽孢杆菌对于实现GlcNAc的工业化具有较大意义。基于中心氮代谢与中心碳代谢之间的关联,通过辅因子工程优化中心氮代谢网络,重构碳代谢与氮代谢之间的关联,再生氧化型辅因子NAD~+,平衡胞内氧化还原状态的同时适当强化胞内谷氨酸供给,促进合成培养基中细胞生长和GlcNAc合成。在敲除内源谷氨酸脱氢酶编码基因rocG和gudB,阻断胞内谷氨酸降解途径的基础上,以内源谷氨酸合成酶GOGAT~(gltAB)编码基因启动子P_(gltA)调控异源NADH依赖型谷氨酸合成酶表达,在不干扰谷氨酸原本转录调控的前提下,再生NAD~+,使胞内NADH水平下降了28%,平衡胞内氧化还原水平,促进了细胞生长和GlcNAc合成;合成培养基中摇瓶发酵,最大细胞干重和GlcNAc分别达到4.0 g/L和6.2 g/L,为利用合成培养基发酵生产GlcNAc,降低生产成本奠定了一定基础。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ460.4

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