大豆脂肪氧合酶好氧催化合成亚油酸氢过氧化物

【摘要】：脂肪氧合酶(LOX)的结构中含有非血红素铁,能专一催化具有cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物(HPOD)。本文从理论上研究了大豆脂肪氧合酶的好氧催化历程及其关键动力学控制因素,并对酶的提取、酶稳定化、酶促反应条件及其产物利用等方面进行了系统的研究。具体研究内容、实验主要结果及结论为: 首次从化学生物学视角研究外源Fe2+、Fe3+等对LOX结构及其催化进程的影响。与外源LA-HPOD、H2O2类似,外源Fe3+影响LOX的紫外吸收光谱,即300～400 nm之间的吸收带随外源Fe3+增多而加强,说明酶催化结构中具有催化活性的Fe3+-LOX增多,但外源Fe2+对LOX紫外吸收光谱仅有微弱影响。催化实验发现,适量的外源LA-HPOD、Fe3+或Fe2+均能消除反应初期的滞后现象,使加氧反应加速;确定酶催化中心的铁元素从Fe2+-LOX到Fe3+-LOX的转化是LOX酶促反应的动力学控制步骤,提出该动力学调控的机制为电子传递机制,进一步完善了有氧条件下酶促亚油酸氢过氧化的反应历程。实验结果表明反应体系中外源LA-HPOD、Fe3+、Fe2+的最佳量分别为0.8 nmol/L、0.5 μmol/L、5 nmol /L。对LOX酶促反应进行动力学分析,在极稀的底物浓度下(小于14.25 μmol/L),反应初期没有滞后现象。采用双倒数作图法求得动力学参数Km = 57.8 μmol/L,vmax = 0.0013/s。酶促反应的初始速度在底物浓度为0.1 mmol/L时达到最大值,在更高的底物浓度下开始下降,不再符合米氏方程,表现出较为明显的底物抑制特征。 采用几种不同的方法从脱脂大豆粉中提取LOX。其中水浸提得到的粗酶液总酶活最高,为6.71×107 U/10 g豆粕,相应比酶活为8.61×105 U/mL粗酶液。碱溶酸沉后经二次盐析得到的酶比酶活最高,达到9.42×107 U/g 固形物。在探索多种添加剂及其保存因素直接使酶液稳定的基础上,创建了一种简单有效的使大豆脂肪氧合酶酶液稳定的方法:即向酶液中添加1%(w/v)柠檬酸钠及1‰(w/v)苯甲酸钠,于25±2℃下放置60天后,酶活保持初始值的90%;120天后,酶活仍保持初始值的73%;而原酶液在室温下放置7天后酶活仅存初始值的21%。此方法克服了以往采用其它方法固定化酶繁琐不经济的缺点,解决了液体酶制剂的保存问题。 采用廉价易得黏土——活性白土为载体制备LOX酶制剂,使该热敏性酶能被简单、廉价、高效的稳定保存。优化条件下获得的以活性白土为载体的酶制剂和以滑石粉为载体的酶制剂在0～4℃冷藏保存20天后酶活损失分别为19.2%及17.7%,远低于粗酶液的酶活损失,并在此后两个月内基本保持酶活损失不再增加。以海藻酸钠为载体采用包埋法制备的酶制剂——酶珠在75%的甘油水溶液中于室温下保存33天后酶活基本保持不变;四个月后酶 WP=9 活保持90%;六个月后酶活保持77%。 以大豆脂肪氧合酶液为催化剂,水相体系LOX酶促反应在底物浓度为4 g/L,m(亚油酸): m(AEO4)=1:1,温度10℃,pH 9及反应时间30min的优化条件下,产物HPOD的产率提高到92%。经LC-MS分析,确定产物HPOD中以亚油酸氢过氧化物为主(89.16%),还含有亚麻酸氢过氧化物(8.21%)及少量的副产物氧代二烯酸(2.63%)。HPOD经还原后得到仍含有共轭体系的羟基酸HOD,包括两种异构体13-HOD和9-HOD(2.1:1)。LA-HOD经氧化得到的产物初步判断为主要含有二元酸(C9)和多羟基脂肪酸(C18)的混合物。