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《江南大学》 2004年
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米胚谷氨酸脱羧酶性质及其富集γ-氨基丁酸研究

张晖  
【摘要】:本论文对米胚谷氨酸脱羧酶(GAD)的分离纯化、酶学特性、光谱性质和氨基酸残基的化学修饰等进行了深入的研究,并应用米胚GAD及其活性调节机制制备了高γ-氨基丁酸(GABA)米胚。 首先研究了米胚中GABA的测定方法,结果发现比色法误差较大,无法作为米胚中GABA的定量测定方法。而纸层析法精密度高,虽然比HPLC?法的测定结果略低,但差异不大,适合用于大量米胚样品的测定。 通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200 凝胶过滤色谱和Glu Sephrose CL 4B亲和色谱等分离纯化技术对米胚GAD进行了分离纯化,从米胚中分离得到的GAD经 SDS-PAGE鉴定为单一组分。体积排阻高效液相色谱测得米胚GAD的相对分子质量为78k,SDS-PAGE测得其亚基的相对分子质量为40k,因此米胚GAD酶蛋白是由两个相同的亚基构成的二聚体。 米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6。米胚GAD的热稳定较差, 75℃时酶基本完全失活。但米胚GAD在较宽的pH范围内(pH4.5-8.0)都较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对Glu的Km值为32.3mmol/L,Vmax为1.159mg/min;对PLP的Km值为1.7μmol/L ,Vmax为1.171mg/min。 Ca2+浓度达到500μmol/L时对米胚GAD的激活作用最强,可使酶的相对活性达到145%,GAD的表观米氏常数 Km’为25.9mmol/L,小于米胚GAD对 Glu的Km,说明Ca2+提高了酶与底物的亲和力,对米胚GAD的活性确有较强的激活作用。 在含PLP体系中,纯化的GAD的酶活性大大提高。GAD脱辅基后酶活完全丧失了,但是加入PLP后活性基本得以恢复,说明PLP从米胚GAD分子中的脱除是一个可逆过程。 米胚GAD的紫外-可见光谱特征为除280nm以下与蛋白质有关的吸收峰以外,420nm处有一个弱吸收峰,这是PLP与米胚GAD主链结合后产生的吸收峰。米胚GAD的荧光光谱分析表明,米胚GAD主要表现为Tyr残基的荧光特征,米胚GAD脱辅基前后的荧光发射光谱完全相似。 米胚GAD氨基酸残基的化学修饰研究表明,米胚GAD中的His残基与其酶活性有关,但可能不是其活性所必需的基团。Arg残基则是酶活性的必需基团,并且整个酶分子中有一个Arg残基为活性必需基团。底物GLu对Arg残基的修饰有着很强的保护作用,因而可推测说明Arg残基可能位于酶的底物结合位点。米胚GAD的His和Arg残基被修饰后,荧光发射光谱有着非常相似的变化,Trp残基的荧光发射基本被猝灭了,说明酶蛋白微区的 WP=10 构象发生了变化。 CD光谱分析表明,米胚GAD的二级结构中, α-螺旋占13.2%,β-折叠占38.3%,是一种高β-折叠蛋白。米胚GAD脱辅基后蛋白质的二级结构的变化是部分β-折叠结构转变为了回转结构。His和 Arg残基被修饰后,酶蛋白的二级结构有较大的变化,底物对Arg残基修饰引起的结构变化有保护作用。分析米胚GAD二级结构的变化与酶活性的关系发现,米胚GAD二级结构中α-螺旋结构的维持对酶的活性可能更为重要。 通过对水浸泡工艺进行优化,并利用Ca2+激活GAD,米胚中GABA的量可以由未富集前的28mg/100g提高到615mg/100g左右,比资料报道有较大提高。 利用胰蛋白酶水解可以进一步提高GABA的富集量,在最佳条件下,GABA产量可达2.3g/100g,比GABA-RG1提高了2倍。 外加Glu和添加米胚GAD的激活剂是制备高浓度GABA的有效方法。最佳工艺条件是:pH5.6、0.08mol/L磷酸缓冲液, PLP和Ca2+的添加量分别为2 mmol/molGlu和20mmol/molGlu,米胚的用量为42.5U/mmolGlu,料液比为1/10,反应时间和温度为6h和40℃。产品中GABA含量为20.6g/100g,比GABA-RG2又提高了7.8倍,并且Glu的转化率可以达到100%。 动物实验表明, GABA-RG可显著促进小鼠GH的分泌和后腿肌重的增长,对小鼠力竭游泳时间和爬杆时间有显著地延长作用。还可使运动后小鼠血乳酸的含量明显下降,血清尿素氮含量明显降低,肝糖原含量的显著提高。这些结果表明 GABA-RG能促进小鼠GH分泌并提高运动能力。根据国家卫生部关于保健性食品的评价指标,可以判定GABA-RG具有抗疲劳的作用。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ914

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【引证文献】
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5 徐昕红;曲卫敏;黄志力;;1型GABA转运体在基础睡眠-觉醒行为及睡眠内稳态调节中的作用[A];中国睡眠研究会第六届学术年会论文汇编[C];2010年
6 韦习会;漆兴桂;夏东;蒋金湖;;日粮添加γ-氨基丁酸对育肥猪生长和饲料利用的影响[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
7 郑洪健;叶立斌;励建荣;韩晓祥;;2,4-二硝基氟苯柱前衍生RT-HPLC法测定杨梅等样品中γ-氨基丁酸(GABA)[A];中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集[C];2010年
8 李岩岩;贺立龙;郭尚敬;;盐胁迫条件下GABA对小麦幼苗生长发育的影响[A];第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2010年
9 赵晓民;夏作理;高允生;刘卫;王德才;朱玉云;张继国;乔现福;;中枢γ-氨基丁酸对清醒活动高血压大鼠血压调控的影响[A];中国微循环学会第五届中国微循环学术大会论文摘要汇编[C];2004年
10 费俭;;GABA转运蛋白1转录调控的研究[A];中国遗传学会模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张名位 张孝祺 张媛;稻米下脚料中有宝可寻[N];农民日报;2002年
2 本期主讲人:江南大学食品科学与技术国家重点实验室教授 江波;天然伽玛氨基丁酸(GABA)的应用[N];中国食品报;2009年
3 本期主讲人:江南大学食品科学与技术国家重点实验室教授 江波;天然伽马氨基丁酸(GABA)应用前景广阔[N];中国食品报;2009年
4 唐明秀;稻谷副产品开发方向[N];中国商报;2000年
5 本报记者  左丹;保胚米请袁院士品尝[N];湖南日报;2006年
6 本报记者 许巍;全稻原米走进百姓生活[N];中国质量报;2010年
7 周国兵;营养大米产业亟待规范[N];中国质量报;2006年
8 南京农业大学动物科技学院 韦习会 南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室 赵茹茜 陈杰;日粮中添加GABA对断奶子猪增重和饲料利用的影响[N];中国畜牧兽医报;2009年
9 孙淑华;粮油搀伪的简单识别[N];中国矿业报;2001年
10 曹丽君;用转基因技术可治疗神经痛[N];新华每日电讯;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张晖;米胚谷氨酸脱羧酶性质及其富集γ-氨基丁酸研究[D];江南大学;2004年
2 刘志广;腺苷A_1受体在癫痫发病机制中的作用及其与GABA信号通路相关性的研究[D];华中科技大学;2013年
3 罗文萍;GABA信号在围植入期小鼠子宫中的表达及功能研究[D];重庆医科大学;2012年
4 高尚锋;神经递质GABA和NO在抑郁症患者和应激模型中的病理意义[D];浙江大学;2012年
5 李耕林;鲫鱼视网膜神经节细胞上的γ-氨基丁酸和甘氨酸受体[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
6 李莹;脂筏对GABA_B受体的调控机制研究和GABA_B受体活性荧光探针开发[D];华中科技大学;2009年
7 许婵娟;GABA_B受体神经保功能的分子机制研究及其与G蛋白动态相作用研究[D];华中科技大学;2011年
8 高飞;正常人群脑内GABA含量与年龄相关性的磁共振波谱研究[D];山东大学;2012年
9 杨颖;GABA-A受体调节动脉粥样硬化的作用及其机制的研究[D];华中科技大学;2013年
10 伍炯星;甘露醇对GABA介导的抗痫作用机制研究[D];中南大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 叶砚;高产γ-氨基丁酸红曲菌种培育及深层发酵关键技术研究[D];浙江师范大学;2010年
2 赵文静;γ-氨基丁酸对蛋鸽产蛋性能的影响及其机理研究[D];浙江大学;2010年
3 何婷;慢性应激性抑郁发生与海马Glu和GABA水平变化及其受体机制[D];陕西师范大学;2011年
4 汪珍珍;同病异治复方对急性癫痫模型的作用及对PTZ点燃大鼠GABA传导通路的影响[D];南方医科大学;2010年
5 缪存影;高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选鉴定、条件优化及谷氨酸脱羧酶基因的克隆[D];浙江师范大学;2010年
6 刘宁宁;产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及作为酸奶发酵剂条件的研究[D];东北农业大学;2010年
7 姜杰;小鼠γ-氨基丁酸转运蛋白亚型Ⅰ(GAT1)与疼痛[D];浙江大学;2004年
8 张华永;γ-氨基丁酸(GABA)对玉米幼苗抗逆性的效应、作用机理及调控[D];山东农业大学;2010年
9 张敏;损毁腹外侧视前核后抑制结节乳头体核γ-氨基丁酸重摄对大鼠睡眠—觉醒时相的影响[D];兰州大学;2011年
10 康艳伟;GABA-R与Glu-R在糖尿病视网膜病变发生中作用机制的研究[D];昆明医学院;2011年
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