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生物转化法生产香草醛的研究

李永红  
【摘要】:香草醛是食品、饮料等工业中应用最广泛的香料之一,还可作为保鲜剂及医药等工业的原材料,需求量很大。香草醛目前主要由化学方法制备,随着生活水平的提高,人们对健康和营养越来越关心,对天然香草醛的需求量也越来越大,但用化学合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取,但由于香子兰栽培需要人工授粉,难以扩大种植规模,这样得到的香草醛量少而价高,不能满足日益增长的需求。这促使研究人员寻找生产天然香草醛的替代方法。欧洲的立法机构认为以动植物材料为原料通过物理方法、酶法或微生物方法所生产的物质均属于天然产物。因此利用生物转化法生产天然香草醛是很有前途的替代方法之一。 生物转化法是目前生物技术领域的研究热点,对此投入力量进行研发,会给国家带来巨大的经济效益,同时也有益于人民生活水平的提高。在生物转化法生产香草醛的研究中我们取得的主要研究成果如下: 建立了分析底物和产物的比色法、TLC法和HPLC法。比色法方便快速、成本低廉,但受许多因素的干扰,只能用于半定量;TLC法成本也较低,但由于板厚度的影响,板与板之间的差别较大,准确度受到影响,也只能用于粗定量;HPLC方法可对底物和产物进行同时测定,准确度高,其测定结果可信度高,但测定成本较高。在实验过程中可根据具体需要决定选用何种方法,对于要求快速测定的样品,可用比色法或TLC法,以节省时间和成本;对于要求结果精确的样品可采用HPLC方法,以保证结果的可靠性。 阿魏酸对微生物的毒性较小,是微生物转化法中最常用的底物。我们对微生物一步转化法生产香草醛进行了研究,发现一株地中海拟无枝菌能由阿魏酸产生少量香草醛,对其斜面培养条件、摇床培养条件及转化条件进行了初步优化。但该菌株只能产生少量香草醛(22 mg/L),离工业化生产的要求相去甚远,但能产少量香草醛的菌株有希望通过代谢阻断突变成为高产菌株。 丁香酚可在工业规模上从丁香油中提取,丁香酚经异构化即得到异丁香酚,它们的价格比二步法底物阿魏酸低得多,大豆脂氧合酶粗酶也非常廉价易得,因此用大豆粗酶为酶源,异丁香酚为底物的酶转化法很有前途。我们对这个工艺进行了系统的研究。 对转化用大豆粗酶的提取方法、性质及冻干粉的性质进行了研究。首先对大豆脂氧合酶的初步纯化工艺进行了研究,确定了粗酶的纯化工艺;然后对粗酶的性质进行了研究,发现其最适pH值为9,在中性和酸性条件下几乎没有活性。液态酶的稳定性较差,因 WP=10 此又对冻干粉的性质进行了研究,发现冻干粉的储藏稳定性很好,并且其转化效果与新提取的酶液相当;最后对不同品种的大豆进行了筛选,找到了用于实际生产的最合适的酶源。另外,还尝试了脂氧合酶同工酶的分离,经DEAE-Cellulose DE-52柱分离以后可以得到几种同工酶,但研究结果与文献报道的结果并不相同。 进行了大豆粗酶转化异丁香酚生产香草醛的条件研究,主要对转化过程中的各种操作参数如:温度、pH值、装液量、加酶量、底物量及底物加入方式等进行了优化,还针对转化中遇到的实际问题采取了相应的措施,如:加入氧载体、H2O2以增加供氧量,加入各种吸附剂和乳化剂以促进底物与氧气及酶的接触。在这些研究的基础上建立了最适转化方法。用自转化效果最好的大豆中提取的粗酶在最适条件下转化36 h可得到3.665 g/L香草醛。 研究了底物和产物的分离提取方法。结果发现用正己烷分步萃取法对异丁香酚的回收效果较好,但对香草醛的回收效果不佳。因此我们在选择萃取溶剂的基础上对香草醛的提取方法进行了改进,另外还对样品预处理方法进行了研究。在这些研究的基础上建立了分别回收香草醛和异丁香酚的方法,用这个方法可将香草醛和未转化的异丁香酚分别加以回收,其加标回收率均接近100%。 对转化机理进行了探讨。不同的证据表明脂氧合酶在转化中起着重要作用,脂氧合酶催化异丁香酚转化为香草醛的过程可能符合LOX途径。另外还发现在酶转化过程中存在着非酶转化现象。最后根据文献和实际转化结果对转化过程中可能存在的反应历程进行了推测。


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