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《江南大学》 2005年
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食品中黄曲霉毒素B_1金标免疫层析检测方法研究

孙秀兰  
【摘要】:强的化学致癌物质,广泛存在于各种食品和饲料中,严重威胁人类和动物的生命安全。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,已无法满足现场快速检测的要求。因此,研究和建立一种方便、安全和快速的检测方法意义深远。在此,作者以单克隆抗体和纳米金合成标记技术为基础,根据免疫层析的原理,建立了快速、简易的食品中AFB1的纳米金标免疫层析检测方法,并对其相关机理进行了深入探讨。 首先通过碳二亚胺法合成AFB1与BSA偶联物,构建AFBl完全抗原。反应起始摩尔比为AFB1-O:载体蛋白BSA 20:1,采用二甲基甲酰胺DMF和PBS(PH7.4)溶液混合溶剂系统,所得偶联物中AFB1-O与BSA的摩尔比为9.34.:1,AFB1-O的利用率为46.7%。通过荧光光谱研究偶联反应对BSA的构象影响。结果表明,AFB1-O对BSA具有荧光猝灭作用,偶联反应使得BSA疏水性增加。将AFBl完全抗原免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合、亚克隆和扩大培养,成功筛选出2株稳定分泌特异性抗AFBl单克隆抗体的细胞株,分别为3A7和5D3。3A7和5D3产生的单克隆抗体效价分别为20,0000和7,0000,亲和常数分别为3.81×10~7和3.43×10~7L/mol,亚类类型均为IgG2a与AFB2、Gl、G2和M2无明显交叉反应,与AFM1呈现出弱的交叉反应,分别为4.08%和2.33%。 以10nm金溶胶为例,正交实验优化单分散性金溶胶合成条件。获得的金颗粒平均粒径为10.7 nm,变异系数14.2%。通过紫外.可见光光谱研究不同粒径纳米金溶胶形成过程,探讨反应动力学特征和反应机理。结果证实,反应的初级阶段形成大的空心球体晶核,然后在球体内部逐渐生成小金原子聚集体,聚集体不断分散,逐步形成一定直径的金胶颗粒。球体晶核生成小颗粒聚集体的时间由还原剂的量决定。动力学分析显示,后期反应近似符合一级反应规律。合成了五种不同粒径的金溶胶(10~70 nm范围),并对其进行了表征,结果表明,金溶胶粒径均一,变异系数均小于15%,平均粒径分别为10.7nm,14.4 nm,25.1 nm,36.9nm,67.4nm。 通过研究纳米金溶胶与AFB1单克隆抗体(McAb)作用过程,确定稳定标记上述五种粒径金溶胶McAb的最适浓度分别为0.07,0.051,0.033,0.019,0.012 mg/ml,作用时间为5min,pH为7.4。将金标探针复合物进行透射电镜,红外光谱和免疫反应性鉴定,结果表明,McAb的红外光谱未发生明显改变,McAb的免疫亲和常数由3.81×10~7提高到4.14×10~7,效价由20,0000提高到22,0000,常温贮藏60d时,稳定性由42%提高到53%。 通过荧光光谱和圆二色谱研究纳米金与AFBl单抗McAb的相互作用机理。结果表明,纳米金对McAb产生静态猝灭,猝灭的速率常数随着温度升高而降低。产生荧光猝灭的原因是,McAb的色氨酸残基与纳米金颗粒之间发生了FOrster偶极一偶极无辐射能量转移。纳米金溶胶与McAb结合位点数为0.8928,结合常数KA为7.009×10~3。根据反应前后热力学焓变⊿H和熵变⊿S,判断氢键和范德华力为纳米金溶胶与McAb之间的主要作用力。二者反应后McAb所处环境的极性未明显改变。McAb的构象组成发生了变化,a-螺旋含量由原来的52.5%升高至54-2%,β-折叠的含量由21.O%降低至19.8%,转角含量由4.6%升高至7.3%,无规则卷曲20.2%略升高至20.5%。McAb与金纳米粒子作用后整体
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TS207.3

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 任娟;;胶体金免疫层析技术研究现状及进展[J];新疆畜牧业;2011年12期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
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3 孙凤霞;三聚氰胺单克隆抗体制备及其高灵敏快速检测技术研究[D];江南大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘丽强;19-去甲睾酮胶体金免疫层析试纸条的研制[D];江南大学;2007年
2 成炜;黄曲霉毒素B_1金标免疫斑点检测方法研究[D];华中农业大学;2008年
3 李秋生;苯二氮卓类药物残留免疫分析方法的研究[D];江南大学;2008年
4 徐一平;动物源性食品中硝基呋喃类药物残留分析研究[D];江南大学;2008年
5 才琳;抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体和单链抗体的制备及活性研究[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
6 张甄;同时检测黄曲霉毒素B_1和玉米赤霉烯酮免疫层析试纸条的研制[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
7 樊晓博;黄曲霉毒素B_1免疫分析方法研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 卢守英;黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条的研制[D];扬州大学;2010年
9 刘雪芬;基于环糊精的黄曲霉毒素B_1荧光增敏检测技术研究[D];中国农业科学院;2011年
10 刘焕春;谷物中黄曲霉素B_1的间接竞赛争化学发光酶免疫分析方法的研究[D];南昌大学;2011年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 路戈,刘宝顺,刘春霞,王德斌,曹明华;抗黄曲霉毒素B_1单克隆抗体的制备及特性[J];生物工程学报;1995年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 王春红;王瑞;沈路;姜兆辉;;竹原纤维增强聚乳酸完全可降解材料的性能研究[J];工程塑料应用;2008年01期
3 张浩;杨毅;潘见;;LC—MS法测定花生中黄曲霉毒素的研究[J];安徽化工;2007年04期
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7 孙高超;孙圣君;刘高升;张娜;毕可东;;猪血免疫球蛋白G提取及分子量测定[J];安徽农业科学;2009年23期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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5 张浩;孙力平;;双波长紫外分光光度法测定渗滤液COD的研究[A];第五届全国水处理化学品行业年会论文集[C];2009年
6 曹爱智;籍立民;娄倩倩;;胆汁酸对肉鸡生产、屠宰性能和免疫功能的影响[A];2009山东饲料科学技术交流大会论文集[C];2009年
7 方洪波;;胜利油田三次采油采出液处理技术进展[A];山东石油学会石油天然气注水及水处理技术中心站油田注水及水处理技术研讨会论文集[C];2008年
8 陈婧;季宇彬;王向涛;;脂质体及传质体的研究概况[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年
9 杨新岐;张晶;姜海龙;孙莉;;应用纳米复合锌粉及稀土的粉末渗锌技术研究[A];第三届中国国际腐蚀控制大会技术推广文集[C];2005年
10 马洪敏;王晋;刘树元;闫涛;于伟;李燕;魏琴;;荧光光度法研究荧光镓与蛋白质的相互作用[A];中国化学会第二十五届学术年会论文摘要集(下册)[C];2006年
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1 王冰;EB病毒潜伏膜蛋白2A特异性CTL表位筛选及免疫功能研究[D];南京医科大学;2009年
2 戴银;鸡MHCⅠ类分子结构与抗病性关系的研究[D];安徽农业大学;2010年
3 王春艳;浓度参量荧光光谱油种鉴别技术研究[D];中国海洋大学;2010年
4 杨爱玲;单个油气包裹体检测技术及应用[D];中国海洋大学;2010年
5 吴异健;两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用[D];福建农林大学;2010年
6 许彩虹;大豆球蛋白糖基化接枝改性及其热聚集行为研究[D];华南理工大学;2010年
7 宋建荣;7YSZ/Al_2O_3/Ni-343多层热障涂层的同步合成及其性能研究[D];武汉理工大学;2010年
8 肖深初;三嗪卟啉衍生物的合成、表征及其生物活性研究[D];湖南大学;2009年
9 焦新安;重组卡介苗诱导T细胞免疫应答的分子、细胞机理研究[D];扬州大学;1999年
10 刘阳;小鼠睾丸足细胞体外诱导成熟T淋巴细胞凋亡及其机理的实验研究[D];第二军医大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
2 邢春芳;豆粕中胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其间接竞争酶联免疫吸附检测方法的研究[D];华中农业大学;2010年
3 白家媛;樱桃谷鸭CD8α胞外区多肽的原核表达、抗体制备及初步应用[D];华中农业大学;2010年
4 曹晓琴;动物源食品和饲料中三类真菌毒素定量/确证方法研究[D];华中农业大学;2010年
5 李孜音;AFB1对高表达CYP2A13的BEAS-2B细胞的毒效应研究[D];南京医科大学;2010年
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7 易敏;钨酸盐基荧光粉的制备及性能研究[D];广西师范学院;2010年
8 陈晓英;喜树碱与生物大分子相互作用的光谱研究[D];郑州大学;2010年
9 闫娜利;化学发光酶免疫分析法测定磺胺对甲氧嘧啶[D];郑州大学;2010年
10 王俊亮;超声波辅助Huisgen-Click反应在白杨素改造中应用及其与蛋白的相互作用研究[D];郑州大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐佩;黄龙峰;李瑞忠;;不同pH的三聚氰胺水溶液溶解性能研究[J];安徽化工;2008年06期
2 周元军;;饲料中黄曲霉毒素的危害与防治研究进展[J];安徽农业科学;2006年05期
3 刘爱红;张琳;;农药残留与食品安全[J];安徽农业科学;2007年13期
4 陈丹;孙广瑞;柳增善;;辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用[J];安徽农业科学;2007年26期
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6 张毅;华福平;童燕;李晓亮;;花生黄曲霉毒素的危害及预防[J];现代农业科技;2010年01期
7 陈辉;张剑波;王维敬;杨宇翔;;壳聚糖固定化云芝漆酶的制备及特性[J];北京大学学报(自然科学版);2006年02期
8 周艳梅;徐文国;童爱军;;新型钯荧光探针的应用研究[J];北京理工大学学报;2006年04期
9 黄飚,肖华龙,朱利国,谭成,蔡刚明,金坚;CA19-9时间分辨荧光免疫分析方法的建立及应用[J];标记免疫分析与临床;2001年01期
10 戴长生;Anytest-2000时间分辨荧光分析仪介绍[J];标记免疫分析与临床;2005年02期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 史建荣;小麦赤霉病菌与寄主小麦的互作研究[D];南京农业大学;2000年
2 黄向华;杂色曲霉素生物毒性效应及致癌性研究[D];河北医科大学;2002年
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4 黄飚;赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B_1的超微量免疫分析[D];江南大学;2006年
5 钟秋平;壳聚糖、1-MCP处理对热带水果保鲜的研究[D];江南大学;2006年
6 马良;黄曲霉毒素B_1高灵敏度检测技术研究[D];中国农业科学院;2007年
7 张奇;倍硫磷和速灭威半抗原分子设计及其免疫效果研究[D];南京农业大学;2007年
8 张静;川楝素免疫分析方法及其应用研究[D];西北农林科技大学;2008年
9 杨泽晓;醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体及ELISA检测技术研究[D];西北农林科技大学;2008年
10 万忠海;抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D];吉林大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李晓霞;流动注射化学发光分析新方法的研究[D];陕西师范大学;2003年
2 段小华;花生黄曲霉抗性研究[D];华南师范大学;2004年
3 雷永;花生对黄曲霉菌侵染抗性的分子标记[D];中国农业科学院;2004年
4 侯新东;红豆草胰蛋白酶抑制剂性质的研究(续)与一级结构的测定[D];新疆农业大学;2004年
5 韦林洪;农药多残留免疫亲和色谱技术研究[D];扬州大学;2005年
6 冯守爱;壳聚糖保鲜膜界面特性的研究[D];广西大学;2005年
7 杜晓昱;禾谷镰刀菌产毒分析及其毒素检测方法的研究[D];福建农林大学;2005年
8 康庄;菠菜种子胰蛋白酶抑制剂分离纯化与性质研究[D];四川大学;2005年
9 王宇萍;饲料中黄曲霉毒素B_1检测方法的研究[D];四川农业大学;2004年
10 林斯;氯霉素酶促化学发光免疫分析方法的建立[D];中国原子能科学研究院;2005年
【二级引证文献】
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1 刘磊;李小兵;吴殿君;王建国;唐佳佳;杨威;王晓旭;王哲;;黄曲霉毒素免疫学检测方法的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年07期
2 崔耀文;夏曦;王媛媛;沈建忠;;动物组织中吩噻嗪类和苯二氮卓类残留仪器分析的研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年02期
3 曲秋颖;鲍蕾;石媛嫄;梁成珠;王雄;;黄曲霉毒素的检测技术及预防措施[J];农产品加工(学刊);2011年08期
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 孙凤霞;三聚氰胺单克隆抗体制备及其高灵敏快速检测技术研究[D];江南大学;2011年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 才琳;抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体和单链抗体的制备及活性研究[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
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7 刘雪芬;基于环糊精的黄曲霉毒素B_1荧光增敏检测技术研究[D];中国农业科学院;2011年
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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3 胡唯元;“纳米试纸”:致命疾病早知道[N];科技日报;2004年
4 新华社记者 李柯勇;挂面:合格率逾九成[N];新华每日电讯;2003年
5 记者白剑峰;乳品中无抗生素 蔬菜农药残留少[N];人民日报;2002年
6 梁奇;制定标准指标应严谨[N];中国质量报;2003年
7 周燕华;“泰山石”擎起科研天空[N];中国国门时报;2005年
8 李小根;常州小食品勇闯国际大市场[N];中国国门时报;2004年
9 夏文俊;我国口岸反生物恐怖现场快速检测实现零突破[N];中国质量报;2005年
10 卫生部食品卫生监督检验所 李凤琴 计融;黄曲霉毒素——I级致癌物[N];健康报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙秀兰;食品中黄曲霉毒素B_1金标免疫层析检测方法研究[D];江南大学;2005年
2 杨苏珍;猪O型口蹄疫抗体免疫层析试纸的研制及应用[D];河南农业大学;2010年
3 徐抒平;胶体金光谱性质研究及其在免疫检测方面的应用[D];吉林大学;2006年
4 任曼;环境与生物样品中PCDD/Fs和DL-PCBs的分析方法与环境行为初步研究[D];中国科学院研究生院(广州地球化学研究所);2006年
5 耿成怀;常规和小型化毛细管电泳—电化学检测技术在食品药品和生物样品分析中的应用研究[D];华东师范大学;2007年
6 王海鹰;冰核细菌对模拟食品冷冻特性的影响研究[D];浙江大学;2007年
7 洪文艳;UPT十通道免疫层析试纸盘检测技术平台的建立及其在鼠疫菌抗体谱筛查中的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
8 江天宝;脉冲强光杀菌技术及其在食品中应用的研究[D];福建农林大学;2007年
9 蒿艳蓉;银杏叶提取物(EGb761)抑制黄曲霉毒素B1诱发大鼠肝癌过程中的作用及其机制[D];广西医科大学;2008年
10 邱萍;化学计量学用于食品中有机农药残留量分析的研究[D];南昌大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 白亚龙;一种基于量子点荧光微球的高灵敏度免疫层析技术初步研究[D];上海师范大学;2010年
2 王俊双;食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫快速检测技术研究[D];江南大学;2008年
3 卢守英;黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条的研制[D];扬州大学;2010年
4 杨书豪;血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快速检测法的建立及其在肝细胞肝癌诊断中的应用[D];郑州大学;2002年
5 郭琳;富硫功能化合物在纳米粒子表面的组装[D];苏州大学;2004年
6 王浩然;UPT十通道免疫层析技术在食源性致病菌多重检测中的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
7 陈昕;三聚氰胺单克隆抗体研制及应用研究[D];重庆理工大学;2010年
8 刘自光;解毒酶基因GSTT_1、EPHX多态性与肝癌的相关性[D];广西医科大学;2003年
9 蒋芸;表面增强拉曼光谱在标记免疫检测中的应用[D];苏州大学;2005年
10 张聪惠;纳米金粉的制备研究[D];西安建筑科技大学;2001年
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