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《江南大学》 2005年
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基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母

张梁  
【摘要】:酒精发酵的糟液中含有一定量的糖未能被酿酒酵母有效利用,其中最多的是蜜二糖和纤维二糖。在纤维质原料酒精发酵时,纤维二糖是纤维素酶水解纤维素的反馈抑制物和纤维素酶系的主要产物,纤维素的有效酶水解需要高β-葡萄糖苷酶活的纤维素酶。在浓醪酒精发酵过程中和纤维素酶水解过程中分别添加α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,能够达到消耗蜜二糖和纤维二糖的目的,并解除纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制,但是其生产成本必然随外加酶的成本变化。本文以工业生产菌株Saccharomyces cerevisiae Y为研究对象,以基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母的构建和应用为目标,通过修饰酵母生物合成甘油的相关基因,即在酵母甘油途径关键酶基因GPD1内分别插入α-半乳糖苷酶基因mel和β-葡萄糖苷酶bgl,达到减少副产物生成、在酒精发酵过程中有效利用蜜二糖和纤维二糖的目的,从而提高酒精发酵效率、降低酒糟有机物含量。同时,在纤维素酒精发酵过程中部分解除纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用,提高纤维素利用率。 通过比较不同类型的色谱分离柱及其分离条件,使用碳水化合物分离柱采用HPLC法对淀粉质原料浓醪酒精糟液成分进行分析,首次建立了同时定性定量分析酒糟清液中蜜二糖、纤维二糖及甘油的HPLC分析方法。使用该方法对不同淀粉质原料浓醪酒精发酵糟液进行分析,结果显示糟液中蜜二糖、纤维二糖的含量都在500 mg/L以上,甘油浓度在4,000-10,000 mg/L。该法快速、简单、方便,灵敏度高,分离效果良好,适用于各类发酵液及混合溶液中这几种物质的监测分析。 根据文献发表的S. pombeα-半乳糖苷酶基因序列设计引物,以S. pombe基因组DNA为模板,通过PCR方法成功扩增出S. pombeα-半乳糖苷酶基因。将扩增出来的S. pombeα-半乳糖苷酶基因基因与pYX-212载体的TPI启动子融合,成功构建酵母融合表达载体pYX-MEL。通过电转化方法成功将pYX-MEL载体转化入酿酒酵母宿主菌株S. cerevisiaeW303-1A,以不含尿嘧啶的YNBG平板筛选得到阳性重组子。酶活测定表明,酿酒酵母转化子表达α-半乳糖苷酶酶活为0.81 u/mL,S. pombeα-半乳糖苷酶基因在实验室酿酒酵母中得到活性表达,并通过实验证明表达mel基因的酿酒酵母S. cerevisiae (pYX-MEL)能以蜜二糖为唯一碳源生长。 根据文献发表的T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,提取总RNA,分离polyA~+ mRNA,通过RT-PCR方法成功扩增出T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因。将扩增出来的T.reeseiβ-葡萄糖苷酶结构基因与pYX-212载体的TPI启动子融合,成功构建酵母融合表达载体pYX-BGL。通过电转化方法成功将pYX-BGL载体转化入酿酒酵母宿主菌株S.cerevisiae W303-1A,以不含尿嘧啶的YNBG平板筛选得到阳性重组子。酶活测定表明,酿酒酵母转化子表达β-葡萄糖苷酶酶活为0.47 u/mL,T. reeseiβ-葡萄糖苷酶基因在实验室酿酒酵母中得到活性表达。酒酵母转化子S. cerevisiae (pYX-BGL)能以纤维二糖为唯
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TS262.2

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