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《江南大学》 2005年
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姬松茸菌丝体中抗肿瘤、免疫活性多糖的研究

姜荷  
【摘要】:姬松茸(Agaricus blazei Murill,AbM)是一种重要的药食兼用真菌。近年来,姬松茸多糖作为抗癌剂、免疫调节剂、抗突变剂和抗菌物质的来源引起了全世界的极大关注。姬松茸发酵生产因其成本低廉、周期短、可全年生产等优点,成为了最具竞争力和吸引力的开发姬松茸活性多糖的有效手段。目前国内外对姬松茸深层发酵发酵菌丝体多糖的研究开发报道不多,在提取方法、分离纯化、结构鉴定等方面缺乏系统、深入的研究。在本论文中,采用实验室5L发酵罐生产的菌丝体为原料,采用不同提取方法对菌丝体多糖进行了分步提取,对其中具有重要研究价值的抗肿瘤免疫活性多糖的提取纯化、结构鉴定及化学修饰进行了研究,主要研究内容如下: 采用热水、冷碱、热碱对姬松茸菌丝体中的多糖分步进行提取分离,共得到6种提取物。结合得率及体内外活性实验结果,从中筛选得到热水提取的水溶性粗多糖HWSP、冷碱提取的水溶性多糖组分CAWSP、冷碱提取得到的水不溶而碱溶性组分CAASP这3种主要的具有研究价值的多糖组分,它们的得率分别为7.73%、5.73%、8.58%。 证明了热水提取的HWSP该组分在20 mg/Kg.d的实验剂量下,对活体小鼠S180移植实体瘤具有59.84%的抑制率及提高荷瘤小鼠机体免疫力的功效;体外对脾淋巴细胞具有显著地促增殖作用,对肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用,对肝癌Bel-7402生长具有显著的抑制作用。采用响应面分析方法,结合体外对脾淋巴细胞增殖的促进增殖及抑制肝癌Bel-7402生长的活性筛选,确定了HWSP的最佳提取工艺条件:提取温度95℃,浸提时间3.5h,水料比3.5:1(湿菌体含水量为85%左右),提取3次,醇沉浓度为85%。 采用乙醇分级沉淀、脱蛋白、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化,并结合体外活性筛选实验结果,得到相对分子质量217884Da、分布均一的活性组分DP-HWSP30-21,该组分得率为1.55g/100g干菌。化学组成分析表明,DP-HWSP30-21是一酸性蛋白多糖组分,蛋白质含量29.69%,多糖含量为67.39%,糖醛酸含量为21.41%;蛋白与多糖是多糖链与丝氨酸通过O-糖肽键连接的;含有4种单糖,单糖组成及其摩尔比例为阿拉伯糖:甘露糖:木糖:葡萄糖=0.05:0.16:0.32:1;含有17种氨基酸。 体外实验证明DP-HWSP30-21中蛋白链的连接可提高糖链体外促脾淋巴细胞增殖的生理活性,而蛋白链本身无生理活性,即蛋白链对糖链的促淋巴细胞增殖起到了活性修饰的作用;当糖链和蛋白链解离后,对Bel-7402细胞的体外抑制活性则完全丧失,说明蛋白链和糖链的整合连接对该组分体外发挥抑制肝癌Bel-7402细胞生长的细胞毒作用是必需的。DP-HWSP30-21与低浓度的化疗药物DHI联合用药具有明显的协同增效作用;DP-HWSP30-21体外对人正常肝细胞无明显的抑制作用。 证明了冷碱(4℃,5% NaOH)提取的水溶性多糖CAWSP在20 mg/Kg.d的实验剂量下,对活体小鼠S180移植实体瘤具有64.66%的抑制率及提高荷瘤小鼠机体免疫力的功效,
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