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《江南大学》 2005年
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D-泛解酸内酯水解酶cDNA的克隆、表达与酶的定向进化

柳志强  
【摘要】:来源于串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536的D-泛解酸内酯水解酶具有高度的立体选择性,可立体专一性拆分DL-泛解酸内酯,生成D-泛解酸。该酶已经成功的应用于工业化,取得了很好的综合效益。为了提高D-泛解酸内酯水解酶的酶活力及在低pH条件下的稳定性,我们在基因水平上对酶进行了研究。 利用RT-PCR方法,扩增得到了编码源于串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)CGMCC 0536的D-泛解酸内酯水解酶cDNA,对其结构进行分析,根据分析结果设计了一对特异引物,成功扩增到了编码D-泛解酸内酯水解酶cDNA的结构基因,结构基因同pMD18-T载体连接后,进行测序。D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因序列已在Genebank数据库申请登记,登记号为AY728018。 将D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因分别插入到大肠杆菌胞内表达载体pTrc99a和分泌表达载体pET20b中,构建重组质粒pTrc99a-LAC和pET20b-LAC。将重组载体pTrc99a-LAC转化大肠杆菌JM109。重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组酶,经SDS-PAGE检测,重组大肠杆菌有分子量约为40 kD的蛋白表达带,重组酶活力平均为39 U/克湿细胞。将分泌重组载体pET20b-LAC转化大肠杆菌BLR(DE3)pLysS,利用IPTG对重组菌进行诱导,D-泛解酸内酯水解酶被分泌表达至大肠杆菌的周质空间,信号肽被正确识别切下后,获得活性的D-泛解酸内酯水解酶,经测定酶活力平均为42 U/克湿细胞。同胞内表达相比,分泌表达酶活力没有明显提高。 将D-泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因同真核表达载体pYX212连接,构建真核表达载体pYX212-LAC。重组表达载体pYX212-LAC电转化尿嘧啶营养缺陷型实验室
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q789

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 蒋孝燕;转糖基活性β-半乳糖苷酶产生菌株筛选、克隆表达及酶学性质研究[D];江南大学;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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6 袁桂梅,于泉德,刘丽秀,李娟,孟宪兴;泛解酸内酯拆分新工艺研究[J];山东化工;2002年04期
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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4 王雪梅;于明锐;谭天伟;;海藻酸钠复合载体固定化细胞拆分D,L-泛解酸内酯[J];北京化工大学学报(自然科学版);2006年03期
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中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 陈芳艳;王林川;冯定远;左建军;;酶工程在饲料工业中的应用[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
2 安艳;杨传平;曲冠证;;柽柳锌指基因TaZF1的功能分析[A];第二届中国林业学术大会——S2 功能基因组时代的林木遗传与改良论文集[C];2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 郑高伟;枯草芽孢杆菌酯酶的发现及其催化制备l-薄荷醇的研究[D];华东理工大学;2011年
3 王秀娟;嗜热真菌纤维二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和内切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造[D];山东农业大学;2011年
4 周波;枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D];山东农业大学;2011年
5 詹冬玲;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3半胱氨酸蛋白酶的研究[D];吉林大学;2011年
6 王刚;耐有机溶剂脂肪酶高活性菌株选育、酶合成及酶学特性研究[D];吉林农业大学;2011年
7 刘俊梅;水生栖热菌海藻糖合酶体外定向进化及重组菌BL35细胞透性化技术研究[D];吉林农业大学;2011年
8 吕自力;奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究[D];石河子大学;2011年
9 冀棉;第四周期人体必需微量元素与生物配体配合行为研究[D];西北大学;2001年
10 苟小军;超氧化物岐化酶的定向进化[D];东北师范大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 梁晓艳;人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用[D];郑州大学;2010年
2 张芹;长链不饱和脂肪酸链延长酶与去饱和酶进化分析及phytophthora infestans中相关基因鉴定[D];山东农业大学;2010年
3 彭福中;链霉亲和素的原核表达及复性[D];江西师范大学;2010年
4 程婧;OmpA信号肽介导的重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵优化[D];江南大学;2010年
5 刘燕雅;扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变[D];福建师范大学;2010年
6 刘媛;猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A、D基因与猪大肠杆菌LTB基因的重组、克隆及原核表达[D];河北农业大学;2011年
7 徐强;Mmc LPPA基因的克隆、表达及对小鼠免疫效力研究[D];西南大学;2011年
8 王贺;含35S启动子的粟酒裂殖酵母分泌型表达载体的构建及功能鉴定[D];吉林农业大学;2011年
9 王一;人成纤维细胞生长因子8b的克隆表达及分离纯化[D];吉林农业大学;2011年
10 姚婷;超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶基因的定向改造[D];江南大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李艳;谭宏亮;何亚辉;袁均林;贺红武;杨旭;丁书茂;李中振;;大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的克隆与表达优化[J];化学与生物工程;2007年10期
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3 项明洁,刘明,李云珠,王耀莉,倪语星,俞善昌;乳果糖对肠道菌群及SIgA含量的影响[J];江西医学检验;2002年02期
4 徐江海,付菊平,向保云,申林杰;乳果糖治疗亚临床肝性脑病临床分析[J];临床荟萃;2005年04期
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6 郑建仙,耿立萍;功能性低聚糖析论[J];食品与发酵工业;1997年01期
7 秦燕,宁正祥,胡新宇;固定化β-半乳糖苷酶催化生成低聚半乳糖[J];食品与发酵工业;2001年11期
8 刘芳;杨瑞金;张文斌;张萃荟;费颖;;薄层色谱法快速分析乳果糖[J];食品与发酵工业;2008年01期
9 李正义;肖敏;卢丽丽;李玉梅;;转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶[J];食品科学;2007年05期
10 孙玉英;张继泉;王淑军;;壳聚糖酶高产菌株的筛选、鉴定及发酵条件的研究[J];食品科学;2009年15期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘建福;脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces Fragilis)LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖[D];江南大学;2004年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 刘丽秀,范鲁娜;D-泛酸钙合成技术综述[J];湖南化工;1999年04期
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5 王太文;泛酸钙的生产及用途[J];精细化工;1988年03期
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【相似文献】
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2 李强;施碧红;罗晓蕾;左祖祯;邢佩佩;刘璐;;蛋白质工程的主要研究方法和进展[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年05期
3 孟宪雨;杨蕾;;定向进化:选择今天的生物催化剂[J];山东化工;2011年05期
4 林章凛,曹竹安,邢新会,刘铮;工业生物催化技术[J];生物加工过程;2003年01期
5 柯涛,马向东,陈明洁,汪越胜,何光源;核苷酸类似物应用于定向分子进化的研究[J];生命的化学;2005年03期
6 李红梅;yh;梅乐和;Vlada Urlacher;Rolf D.Schmid;;定向进化细胞色素P450BM-3的研究[J];生物加工过程;2006年01期
7 曾家豫;杨国兵;廖世奇;;生物酶的定向进化及其应用[J];卫生职业教育;2007年23期
8 吴佳茜;王旻;陈代杰;朱丽;;糖基转移酶定向进化研究进展[J];生命科学;2009年03期
9 李满文,贺福初;分子进化工程[J];科技导报;1995年06期
10 张红缨,孔祥铎,张今;蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化[J];科学通报;1999年11期
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1 林章凛;;分子定向进化的最新进展[A];代谢工程和工业生物技术研讨会论文集[C];2004年
2 陈轶群;曹云鹤;;硫色曲霉木聚糖酶xynB的定向进化[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
3 范树泉;赵晗;卢丽丽;肖敏;;定向进化技术提高α-半乳糖苷酶的转糖基效率[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
4 杨怡然;唐兵;;嗜热蛋白酶WF146的体外定向进化[A];湖北省生物工程学会2004年年会学术报告及论文摘要汇编[C];2004年
5 苟小军;;大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶/水解酶操纵子的定向进化[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
6 王谦;翁晓燕;孙建义;;通过活性位点附近的单一氨基酸替换(L49P)增强木聚糖酶活性的研究[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
7 李梓君;方柏山;杨仲丽;朱春杰;;克雷伯杆菌中甘油脱氢酶的定向进化[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
8 梅乐和;;酶分子定向进化技术的原理、发展和应用[A];第三届全国化学工程与生物化工年会邀请报告[C];2006年
9 闫云君;蔡勇;杨江科;;基于易错POR技术的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)脂肪酶YZO2的定向进化[A];节能环保 和谐发展——2007中国科协年会论文集(一)[C];2007年
10 徐丽华;林章凛;;莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)氢酶的定向进化[A];代谢工程和工业生物技术研讨会论文集[C];2004年
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1 贺鹏;鳗鱼药残控制技术研究取得突破[N];福州日报;2008年
2 本报记者 张亮;让病毒成为纳米电路加工厂[N];科技日报;2006年
3 赖文忠;无药残鳗鱼技术研究获重大进展[N];福建日报;2008年
4 王秀兰;先正达联手帝维萨进军生物燃料[N];中国化工报;2007年
5 何国庆 张灏;在酶制剂生产中的应用(下)[N];中国食品报;2009年
6 柯继;江南大学研制成功焙烤专用脂肪酶[N];中国食品报;2010年
7 唐昀;生物燃料寻求更多新原料[N];东方城乡报;2009年
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4 陈红歌;野油菜黄单胞菌α-淀粉酶性质及其体外定向进化研究[D];南京农业大学;2005年
5 马吉胜;枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、定向进化与非水酶学研究[D];吉林大学;2005年
6 房耀维;Proteus Vulgaris T6脂肪酶分子定向进化研究[D];南京农业大学;2007年
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8 郭康平;Bacillus sp. BSD-8肌酐降解酶系的研究[D];浙江大学;2008年
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10 曾家豫;HRP基因的表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究[D];西北师范大学;2007年
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1 汤晓玲;酯酶的克隆、表达、筛选以及立体选择性的定向进化研究[D];浙江大学;2010年
2 刘鹏;2-氯丙酸脱卤酶的定向进化[D];浙江大学;2012年
3 徐敏;几丁质酶的体外定向进化研究[D];浙江工商大学;2011年
4 王珏;利用定向进化技术提高米黑霉脂肪酶活性和耐热性的研究[D];浙江大学;2012年
5 周琼;扩展青霉脂肪酶的定向进化及其比酶活的提高[D];福建师范大学;2012年
6 王安;台湾乳白蚁肠道宏基因组中新型β-葡萄糖苷酶基因的克隆及定向进化研究[D];中山大学;2013年
7 赖红星;白地霉脂肪酶基因的异源表达与定向进化[D];中国农业科学院;2010年
8 于怡;吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达及其定向进化研究[D];浙江大学;2012年
9 刘明;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ie定向进化的研究[D];东北农业大学;2010年
10 邱玮;阿特拉津脱氯水解酶(TrzN)的定向进化[D];南京农业大学;2011年
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