收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

酿酒酵母β-D-葡聚糖制备、构象及免疫功效研究

刘晓永  
【摘要】: β-D-葡聚糖存在于许多细菌、真菌和高等植物中,它的一个重要来源是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞壁。大量研究表明酵母β-D-葡聚糖可以通过激活巨噬细胞以起到抗肿瘤、抗菌、愈合伤口、抗氧化和降血脂等功效。此外,酵母β-D-葡聚糖在食品工业中被广泛用作于增稠剂、乳化稳定剂和脂肪替代品。 目前国际上还没有酵母β-D-葡聚糖的标准测定方法。常规酵母β-D-葡聚糖的测定一般采用苯酚-硫酸法,测定结果误差较大。在此,本研究建立了一个酵母β-D-葡聚糖测定的新方法:首先利用涡流微珠破壁法对酵母细胞进行破壁,酵母细胞破壁率可达到95.28%;接着采用高浓度酸预处理结合常规酸水解方法对酵母β-D-葡聚糖进行酸水解,酵母β-D-葡聚糖的酸解回收率高达98.76%;在此基础上,由GOPOD法测定出β-D-葡聚糖的含量。新方法的相对标准差和加样回收率分别为0.46%和99.96%。 采用新方法对不同酿酒酵母菌种的β-D-葡聚糖含量进行了分析对比,结果表明酵母中β-D-葡聚糖含量随其菌种不同而有明显差异(P≤0.05),占细胞壁干重比率的最大差异为138.10%,而占细胞干重比率的最大差异高达189.52%。 接下来对酿酒酵母的发酵条件进行了优化。首先进行了单因素实验的研究,并在此基础上,以二次正交旋转组合设计试验,得到培养基模型方程为: Y = 106.89+3.74X_1-8.85X_1~2-5.72X_2~2-7.96X_3~2-7.52X_4~2,经二次多项式逐步回归分析确定了最佳培养基(/100ml)为:葡萄糖3.27 g、蛋白胨(2)1.89 g、酵母膏1.57 g和甘油1.04 g。经过培养基的优化后,酵母β-D-葡聚糖产量由原来的65.80 mg/100ml提高到109.33 mg/100ml。然后,采用正交优化方法进行发酵条件优化,确定主次影响因素依次为:装液量温度起始pH接种量,最适培养条件为:pH5.0、接种量5ml/100ml、温度32℃、装液量60 ml/瓶,经试验验证β-D-葡聚糖量达到128.30 mg/100ml,较发酵条件优化前提高了17.35%。在发酵条件优化基础上,以Logistic、BoxLucas1和SRichards2三种模型对酵母菌生物量和β-D-葡聚糖生成量进行非线性拟合,确定生物量模型以Logistic模型拟合效果最佳,拟合方程:相关系数可以达到0.975,而在β-D-葡聚糖生成模型拟合中,以SRichards2模型最佳,拟合方程:相关系数为0.996;在对基质(葡萄糖)的消耗拟合中,采用Exponemtial ExpDec1模型,拟合方程:相关系数为0.977。 传统酵母β-D-葡聚糖的制备主要采用酸碱法,这易使β-D-葡聚糖发生氧化降解,致使得率偏低,并且会对β-D-葡聚糖的天然构象部分地破坏而使其生理活性受到严重的影响。基于此,本文建立一个由酿酒酵母中分离提取β-D-葡聚糖的新方法,此方法是在较为温和的条件下进行的,包括酵母的诱导自溶、高温和有机溶剂的抽提、均质破壁、生物酶解等步骤。新方法制备的β-D-葡聚糖纯度高达93%,得率为酵母细胞干重的11%。 酵母β-D-葡聚糖不溶性制约其在工业中的应用,本研究采用超声修饰和均相硫酸酯化技术对酵母β-D-葡聚糖进行修饰改性研究。以400W的功率对酵母β-D-葡聚糖进行超声处理,每循环处理时间24s,间歇时间6s,共20个循环,酵母β-D-葡聚糖的平均粒径由起始的56.49μm降到2.33μm;在Urea-DMSO的均相体系中,以硫酸为酯化剂,对酵母β-D-葡聚糖进行均相硫酸酯化反应,硫酸浓度5%,100℃下反应4 h,最终酯化β-D-葡聚糖的取代度和得率分别为0.43和87.97%。 采用了FTIR、EA和NMR等方法对酵母β-D-葡聚糖及其硫酸酯的基本结构进行分析,确定酵母β-D-葡聚糖以β-(1,3)为主链,其中新方法制备β-D-葡聚糖以β-(1,3)为主链每九个单元与一分子葡萄糖通过β-(1,6)键连接,而酸碱法制备β-D-葡聚糖以β-(1,3)为主链每五个单元与一分子葡萄糖通过β-(1,6)键连接;酵母β-D-葡聚糖硫酸酯化学通式为(C6H10O5)20·9SO3·20H2O,硫酸基团取代位置在糖环的C-6上。此外,本研究还采用激光光散射(MALLS)技术结合YFY和KP蠕虫模型的方法进行研究。判定酵母β-D-葡聚糖硫酸酯溶液构象为一种介于柔性链和刚性链之间的半刚性链构象,并得到其分子层面的构象参数:ML = 646 nm-1,q = 5.1 nm,d = 0.99 nm,C∞= 16.33。 最后通过动物试验,证实酵母β-D-葡聚糖及其硫酸酯具有增强免疫功效,其中新方法制备酵母β-D-葡聚糖对Con A诱导小鼠淋巴细转化率具有极显著性差异(P≤0.01),对小鼠NK细胞活性具有显著性差异(P≤0.05);酸碱法制备酵母β-D-葡聚糖对Con A诱导小鼠淋巴细转化率和小鼠NK细胞活性具有显著性差异(P≤0.05);而经超声处理和硫酸酯化之后的酵母β-D-葡聚糖衍生物对Con A诱导小鼠淋巴细转化率、小鼠血清中总补体溶血活性(CH50)和小鼠NK细胞活性均具有极显著性差异(P≤0.01)。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 茅文俊;刘真真;朱虹;朱融融;孙晓宇;姚思德;汪世龙;;激光诱变筛选呼吸缺陷型酵母及其发酵条件优化[J];辐射研究与辐射工艺学报;2009年01期
2 丁新丽,汪天虹,张光涛,卢翌;瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究[J];酿酒科技;2005年09期
3 ;基因工程[J];生物技术通报;1990年08期
4 丁新丽;汪天虹;;分泌两种木霉纤维素酶的酵母菌株的构建[J];山东商业职业技术学院学报;2006年04期
5 乌兰格日乐;翁惠;包宇鹏;;蒺藜多糖铁的制备及铁含量测定[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2009年05期
6 馬振亚;居建民;方亮;;裂解素系統测定方法(酵母多糖法)的初步研究[J];微生物学报;1965年03期
7 林玲,袁生,幸定坤,陆玲,张如海;粟酒裂殖酵母质膜ATP酶的制备及活性测定[J];南京师大学报(自然科学版);1999年02期
8 王纪,蒋海波,姚建铭,薛小莉,谢和金,刘治林;离子注入麦角甾醇酵母选育及发酵工艺[J];微生物学杂志;1998年04期
9 李文清;黎杨;罗进贤;;黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA在酿酒酵母中的表达[J];中山大学学报论丛;1992年03期
10 蔡敬民,Markus Pietzsch,Manfred Rizzi;酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶的诱导、提纯和性质[J];菌物系统;1996年02期
11 郭立忠,郭秀君;酿酒酵母和糖化酵母原生质体形成与再生研究[J];莱阳农学院学报;1997年04期
12 李伟军,丛威,徐方,欧阳藩;酿酒酵母的同步培养方法及其应用[J];微生物学通报;1999年06期
13 鲍晓明,郑华军,秦玉静,汪天虹,高东,李在禄;酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae重组菌株木糖醇发酵的初步研究[J];工业微生物;2000年02期
14 朱新宇;酿酒酵母进级进化过程中的基因丢失现象初探[J];生命科学研究;2003年02期
15 李东栋;郑育声;;不同诱导方式对6-methylsalicylic acid在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的影响[J];海南大学学报(自然科学版);2008年01期
16 安胜欣;江章应;彭成松;;酿酒酵母2B-39 sam2在大肠杆菌中的克隆及表达[J];安徽理工大学学报(自然科学版);2008年03期
17 林晓华;柯崇榕;吴毕莎;郑永标;李力;陈由强;黄建忠;;酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建[J];生物工程学报;2011年04期
18 李桃生 ,刘静 ,陈士怡;通过原生质体融合改建酵母细胞的研究 Ⅱ,酿酒酵母与糖化酵母种间融合杂种的发酵生物学研究[J];浙江大学学报(理学版);1987年03期
19 丁志山,沃兴德;超声波法转化酵母原生质体[J];生物技术;1996年04期
20 苟兴华,刘缨,张义正;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源DNA片段的克隆[J];四川大学学报(自然科学版);1997年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王艳尊;高媛媛;施巧琴;吴松刚;黄建忠;;酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6突变株的构建及hxt1基因的过表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
2 周峻岗;祁庆生;王鹏;;酿酒酵母糖基化过程基因工程改造[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
3 李生强;林琳;;扩展青霉脂肪酶基因在酿酒酵母中的表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
4 何才姑;江澍;朴英杰;;人自噬基因hATG12在酿酒酵母自噬过程中的作用[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
5 黄祖新;薛亮;罗招城;陈由强;叶冰莹;陈如凯;;海藻酸钠-PVA固定化酿酒酵母制备工艺的优化[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
6 黎月玲;古淑仪;谢绍婷;;磺胺嘧啶银贴剂的制备及质量控制[A];广东省药学会2009学术年会优秀论文[C];2010年
7 王颖;史文龙;刘向勇;沈煜;鲍晓明;白凤武;曲音波;;木糖代谢工程在酿酒酵母工业菌株中的建立[A];代谢工程和工业生物技术研讨会论文集[C];2004年
8 张桂敏;曾毓芳;陈雅兰;屠俊;马立新;;rDNA介导的酿酒酵母稳定表达载体的构建和应用研究[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
9 鲍晓明;沈煜;;纤维乙醇全糖发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌的研究与开发[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
10 郭晓贤;宋浩雷;江贤章;黄建忠;;ADH2等位基因缺失的酿酒酵母杂合子的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘晓永;酿酒酵母β-D-葡聚糖制备、构象及免疫功效研究[D];江南大学;2007年
2 刘红芝;酿酒酵母甘露聚糖的制备、结构鉴定及免疫活性研究[D];中国农业科学院;2009年
3 池小琴;酿酒酵母海藻糖代谢工程与抗逆性相关机制研究[D];浙江大学;2010年
4 李新鸣;WEB2基因在酿酒酵母S期检查点调控机制中的作用[D];中国医科大学;2002年
5 于立权;白念珠菌CaPTC6和CaHXT5基因及酿酒酵母ScATP16基因的功能研究[D];天津大学;2010年
6 孙平楠;酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究[D];中国海洋大学;2007年
7 郭娜;呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究[D];吉林大学;2009年
8 熊联明;微胶囊红磷阻燃剂的制备、应用及阻燃抑烟机理研究[D];中南大学;2004年
9 王国庆;杂萘联苯型聚芳醚腈(酮)及其磺化改性超滤膜研制[D];大连理工大学;2005年
10 刘文波;壳聚糖超细胶囊的制备及应用研究[D];东北林业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李聚海;辅酶Q_(10)高产菌株选育及发酵条件优化研究[D];西北农林科技大学;2007年
2 彭帅;电融合法构建海藻糖高产菌株的研究[D];吉林农业大学;2004年
3 刘敏;酵母基微生物絮凝剂性能及作用机制研究[D];重庆大学;2009年
4 吴昊;詹氏甲烷球菌NifH1和酿酒酵母Ndl1的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析[D];中国科学技术大学;2011年
5 方伟辉;大豆糖蜜分离及低聚糖生物纯化的研究[D];江南大学;2004年
6 赵旭成;多元无机凝胶体系的制备、组成与结构研究[D];福州大学;2006年
7 罗松年;低剂量镉诱导酵母细胞氧化损伤的机理研究[D];兰州大学;2006年
8 刘丽丽;酿酒酵母1450产孢培养基的筛选及单倍体的分离[D];西北农林科技大学;2008年
9 蒋维;肠道病毒71型病毒样颗粒的制备、纯化与鉴定[D];北京工业大学;2010年
10 陈华;文昌红树林微生物细胞毒活性物质的筛选[D];华南热带农业大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 邝邺;山东将统一金矿含金量测定方法[N];地质勘查导报;2007年
2 陈英;血清T_(4)、T_(3)的意义[N];农村医药报(汉);2007年
3 张蕾;油气化探试样 测定方法编制完成[N];中国石化报;2003年
4 岳学民;东莞局检测农残添新招[N];中国国门时报;2003年
5 陈昂;健康车有了新标准[N];中国财经报;2008年
6 治;酿酒酵母部分蛋白组图谱公布[N];医药经济报;2002年
7 涂梅;汽车油耗的两种测定方法[N];市场报;2005年
8 李焕如;种子发芽率的测定方法[N];北京科技报;2003年
9 成都 张成液;谈扬声器功率的测定方法[N];电子报;2004年
10 董江凯;一种被忽略的——塑料薄膜摩擦系数测定方法[N];中国包装报;2004年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978