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《江南大学》 2007年
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干酪乳杆菌LC2W胞外多糖制备、功能及结构的研究

艾连中  
【摘要】: 近年来,乳酸菌胞外多糖已成为研究的热点,它不仅具有改善发酵食品流变、口感、和质构的重要作用,而且具有促进人体健康的重要生理活性,如抗诱变、抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇等活性。本文对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的产生条件、分离纯化、生理功能、物化性质以及结构特征等进行了系统研究。 比较了不同乳酸菌培养基对干酪乳杆菌LC2W产生胞外多糖的影响,选择胞外多糖产量较高(83 mg/L)的脱脂奶粉为基础培养基。研究了以脱脂奶粉为基础培养基,添加不同碳源、氮源和其他盐类对胞外多糖产量的影响,其中大豆蛋白胨、葡萄糖和K2HPO4能显著提高胞外多糖产量,通过正交实验确定干酪乳杆菌LC2W优化培养基组成为:脱脂奶粉12.0%,大豆蛋白胨1.0%,葡萄糖1.5%,K2HPO4 0.1%。 采用单因素分析接菌量、培养温度和培养时间对干酪乳杆菌LC2W产生胞外多糖的影响,并通过响应面分析法确定高产胞外多糖工艺优化参数:接种量4.0%,培养温度32.5 oC,培养时间26 hr。最适培养基和最优培养条件(不控制培养基pH)下EPS产量约为137 mg/L。研究发现控制pH 6.0发酵,EPS的产量最大为160 mg/L,较未控制pH时的产量提高了约17%。 发酵液通过加热灭酶后冷却离心除去凝结蛋白和菌体,然后用终浓度4.0%(w/v)的三氯乙酸除上清液中蛋白质,超滤浓缩后,用终浓度75%(v/v)乙醇沉淀得粗多糖LCP,得率为153.4 mg/L。 粗多糖LCP经过DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析分级纯化得到三个组分,由pH 7.6 Tris-HCl缓冲液洗脱得到组分LCP1和LCP2,由0.2~1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱得到组分LCP3,LCP1、LCP2和LCP3分别占LCP质量的35.74%,12.61%和33.34%,总回收率为81.7%。LCP1、LCP2和LCP3在Sepharose CL-6B和HPLC上都显示均一组分,结合紫外、红外图谱和其化学组成分析确定LCP1和LCP2是两种中性多糖,LCP3为一种蛋白质-多糖复合物,其中蛋白质含量约为60%。 胞外多糖LCP1、LCP2和LCP3分别以15 mg/kg体重剂量灌胃自发性高血压大鼠(SHR),每天一次,连续灌胃7天,对照组灌胃生理盐水。结果显示LCP1能显著降低SHR的动脉收缩压(P0.01),最大降压幅度(约20 mmHg)出现在给药后2~4 h,LCP2和LCP3降血压效果不明显。LCP1、LCP2和LCP3对SHR心率均没有影响,说明这三组分对SHR的循环系统未产生不利影响。 胞外多糖LCP1对SHR降高血压的机理研究发现SHR连续灌胃胞外多糖LCP1可显著降低主动脉ACE活性,而对肺、肾及血清中ACE活力没有明显影响,对照组和LCP1组SHR血清中ET-1和CO含量没有明显不同。 体外淋巴细胞培养实验显示,LCP1、LCP2和LCP3均无细胞毒性,体外免疫活性实验可知,胞外多糖LCP1、LCP2和LCP3能显著抑制T/B淋巴细胞的增殖反应和混合淋巴的增殖反应,显示较强的免疫抑制活性。 利用毛细管电泳进一步鉴定LCP1的纯度,通过旋光仪测定LCP1水溶液中的比旋光度[α]52859=+62.0°(H2O;浓度1.12),采用乌氏粘度计测得LCP1水溶液固有粘度[η]为1.930 dL/g。示差折光检测仪测得LCP1在0.1 mol/L的NaNO3溶液中比折光指数增量(dn/dc)为1.20。通过高效凝胶色谱测定LCP1重均分子量Mw为1.236×106 Da、固有粘度[η]为1.875 dL/g、多分散性指数Pd为1.202和Mark-Houwink指数为0.654,Mark-Houwink指数表明LCP1在0.1 mol/L的NaNO3溶液中呈无规卷曲构象。 通过动态激光光散射研究表明LCP1分子在水溶液中聚集比较严重,达到45%,而在NaNO3溶液中几乎不发生聚集,故确定0.1 mol/L NaNO3溶液为研究LCP1溶液分子信息的理想溶剂。采用静态激光光散射测得LCP1在0.1 mol/L的NaNO3溶液中的重均分子量Mw为1.276×106 Da、回旋半径Rg为52.9 nm、第二维里系数A2为2.44×10-4 cm3mol/g2;动态激光光散射测定LCP1水力半径Rh为34.8 nm,ρ值(Rg/Rh)为1.61表明LCP1分子在溶液中呈无规卷曲的构象。 通过对LCP1溶液流变性质研究发现,高浓度LCP1溶液呈剪切变稀,低浓度时,剪切速率对粘度没有影响,溶液粘度随温度升高下降明显,pH对LCP1溶液粘度影响很小,盐可以降低LCP1溶液粘度,粘度降低与盐浓度有关,通过粘弹性研究发现LCP1溶液不能形成胶体。 离子色谱测定LCP1由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比约为3:5:2。通过高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和部分酸水解的化学方法与GC-MS、GC、HPAEC-PAD、1D和2D NMR技术相结合,分析推测出LCP1的结构如下:
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:TS252.53

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