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《江南大学》 2008年
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丝胶肽的制备及其生物活性功能和结构的研究

吴金鸿  
【摘要】: 来源于蚕丝的丝胶作为一种新型的食品蛋白资源,不但具有食用价值而且具有药用价值,因此对丝胶进行功能性食品的开发利用,不仅提升了丝胶作为丝绸加工副产品的经济价值,而且具有较大的社会效益。 本文以丝绸废水中的丝胶为原料,建立了丝胶的提取工艺和酶解工艺;探讨了DA201-C大孔吸附树脂对丝胶酶解产物的精制处理及其分离组分的生物活性;提取丝胶酶解产物中抗氧化性类黑精组分并分析其理化性质和结构特征;以D-半乳糖致衰老动物模型,探讨了丝胶肽抗衰老的效果。本文的研究为开发功能性食品配料――丝胶肽提供了理论基础。 本文首先建立了低温乙醇沉淀法提取丝绸废水中丝胶的工艺流程,并使丝胶的提取率达到64%。理化性质研究结果表明醇提丝胶约含有90%以上蛋白质,1%糖和4%灰分;明显地去除了蚕腥恶臭味,但溶解性有所下降;氨基酸组成中含极性侧链的氨基酸达到70%,疏水性值为2.21 KJ.mol-1,表明醇提丝胶为亲水性蛋白质;醇提丝胶相对分子质量分布比较宽,且多数组分分布在10,000~500,000之间。本文进一步通过扫描电镜(SEM)、差式扫描量热法(DSC)、圆二色性(CD)和红外光谱(IR)的测定探讨了醇提工艺对丝胶蛋白质超微结构和分子构象稳定性的影响。SEM结果表明在低温乙醇溶液中蛋白质分子间产生交联聚集形成致密的球状聚集体结构,当脱乙醇并在水溶液中复溶后,这种聚集作用被减弱,分子展开形成三维的网状结构;DSC、CD和IR结果表明蛋白质分子已发生部分变性,而这种变性可能与β-转角构象的出现有关,即部分的分子链通过β-转角这种折叠的构象进行组装,使分子结构从无序的状态向有序的状态转化,从而导致醇提的丝胶蛋白质的溶解性有所下降。此外,GC-MS分析结果表明使丝胶产生蚕腥恶臭味的风味组分主要是杂环类和烃类的挥发性化合物,经过醇提工艺处理后丝胶的蚕腥恶臭味明显被去除,使丝胶适用于食品的开发和利用。 本文通过比较五种微生物来源的蛋白酶对丝胶的水解能力,确定最适水解酶为AS1398中性蛋白酶;通过单因素试验和响应面分析确定丝胶最佳酶解条件为:pH 6.1,温度55°C,加酶量([E]/[S])2% (w/w %),该条件下的水解度为23.35%。与醇提丝胶比较,丝胶酶解产物的蛋白质含量略有下降,灰分含量和糖的含量增加;丝胶酶解产物相对分子质量主要分布在200~1000之间,含2~5个氨基酸的短肽比例约占50%左右。 本文采用DA201-C大孔吸附树脂对丝胶酶解产物进行精制,即进行初步分离纯化、脱盐和分离褐色组分的处理,结果表明丝胶酶解产物按疏水性的不同利用大孔吸附树脂用乙醇溶液梯度洗脱可分离为四个组分(DK-1,DK-2,DK-3, DK-4);电导率和灰分含量的测定结果表明,利用大孔吸附树脂可以对丝胶蛋白酶解产物中被树脂吸附的组分进行有效地脱盐;通过420 nm特征吸光值的测定和色泽的分析,结果表明DA201-C大孔吸附树脂可以分离提取丝胶酶解产物中黑褐色物质,从而使非褐色的组分(DK-1)达到脱色的效果。经过大孔吸附树脂分离纯化得到含有黑褐色物质的DK-3组分,生物活性分析结果表明DK-3组分具有清除DPPH·的效果,抑制酪氨酸酶活性的作用和螯合Fe2+能力,其EC50分别为2.49 mg/mL,3.13 mg/mL和0.90 mg/mL;将经过纳滤脱盐处理的DK-1组分应用于冻藏鱼糜中,结果表明DK-1组分的添加显著地提高鱼糜肌动球蛋白质的总巯基含量、降低表面疏水性及减缓肌球蛋白质重链(MHC)和肌动蛋白(AC)的降解,说明DK-1组分具有防止鱼糜肌动球蛋白质冷冻变性的作用,而且与浓度存在一定的相关性,在实际应用时,其添加量不宜太高。 本文通过SDS-PAGE结合PAS染色法鉴定出丝胶中含有高分子量的糖蛋白;通过β-消去反应判断丝胶中存在O-连接方式的糖肽键;通过GC-MS分析鉴定出嘧啶、2-(5-氯-2-甲氧基亚苄基)-吡咯和吡啶酮等美拉德反应产生的特征性杂环类化合物。以上结果证实丝胶在酶解工艺过程中发生了美拉德反应,从而为丝胶酶解产物中类黑精的产生提供一定的依据。 本文将经过大孔吸附树脂分离纯化得到的DK-3组分通过聚酰胺柱层析和RP-HPLC进一步分离纯化,得到在220 nm、280 nm和420 nm均有明显吸收的类黑精组分(RP-M)。抗氧化活性测定结果表明RP-M类黑精组分具有清除DPPH·的效果,其EC50为0.13 mg/mL;可抑制H2O2的氧化损伤,具有明显的神经细胞保护作用,但添加量过高时对细胞反而有毒性作用;RP-M组分氨基酸组成中赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)及一些疏水性的氨基酸的含量都明显地增加,说明这些氨基酸是组成类黑精肽骨架结构的主要氨基酸;RP-M组分相对分子质量主要分布在1,000~50,000之间,其中大于7,500的成分含量约占50%,而且MALDI-TOF MS测定的质量指纹图谱表明相对分子质量小于1000的短肽为RP-M类黑精组分基本的肽骨架单元,这些结果说明RP-M组分是通过短肽的复合形成聚合度不等的高分子量混合体。 ESI-MS-MS质谱分析结果表明RP-M组分含有m/z分别为529.8715、462.3399和398.3169的三个特征的肽段,其氨基酸序列结构分别为:IILLLAAKFG、KVIIKPLI和QPVIAHM。这些肽段的氨基酸序列结构上具备抗氧化肽的特征,说明RP-M类黑精组分的肽骨架结构可能与其抗氧化活性相关。此外,特征肽段氨基酸组成中都含有的Lys和Pro,是形成类黑精最具活性的两种氨基酸残基,对短肽的复合和色素分子的聚合可能起到交联的作用。红外光谱分析结果表明RP-M组分结构中含有芳族胺、芳族羧酸和烷烃结构。紫外-可见光谱分析结果表明,RP-M组分在200 nm~380 nm范围内有强的吸收,在275 nm~280 nm处有一个吸收峰。RP-M组分酸水解样品经RP-HPLC分离纯化得到一个在420 nm处有明显吸收的S-4色素组分。红外光谱、紫外光谱和核磁共振的分析结果表明S-4色素组分是一种α-型吡喃糖类物质,说明类黑精组分的色素可由糖基化的物质形成。 本文通过动物试验研究了丝胶肽抗衰老的效果。结果表明丝胶肽可显著提高D-半乳糖致衰老模型老鼠血清中SOD活性和降低MDA含量;可显著增加脾脏的重量;可改善D-半乳糖致衰老模型老鼠学习记忆的能力;减缓D-半乳糖对海马神经细胞的损伤;提高脑组织中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平。结果说明丝胶肽可通过提高体内抗氧化作用,增强机体免疫力功能和延缓脑组织的老化作用起到抗衰老的效果。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:TS201.2

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