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《江南大学》 2008年
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吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的活化机制和生理功能

张东旭  
【摘要】: 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13简称TGase)是一种能够催化蛋白质或肽分子间形成共价交联的酶,是食品领域极为重要的酶制剂之一,同时在医药和纺织等工业领域具有广阔的应用潜力。链霉菌谷氨酰胺转胺酶是目前唯一商业化的能够交联蛋白的酶制剂。已有研究表明,茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)中TGase以酶原(Pro-TGase)形式分泌,并受蛋白酶活化。然而有关链霉菌TGase活化过程的机制还不清楚,链霉菌TGase的生理功能也未见报道。本研究室近来从土壤中筛选到一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株——吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。为进一步推动S. hygroscopicus产TGase的发酵水平,同时也为揭示更多链霉菌TGase的微生物学机制,本论文对S. hygroscopicus产TGase的活化过程及TGase的生理功能进行了研究。主要研究结果如下: 1. S. hygroscopicus液体培养过程中存在从Pro-TGase到TGase的转化过程。 TGase和Pro-TGase存在于S. hygroscopicus液体培养中,可通过乙醇沉淀和阳离子交换色谱(Fractogel EMD SO3-柱)分离等步骤进行纯化。TGase和Pro-TGase的分子量分别为40 kDa和44 kDa。Pro-TGase的N-端氨基酸序列为:ASGDDEEREG。S. hygroscopicus液体培养中TGase以酶原形式分泌并存在从酶原到成熟酶的转化过程。S. hygroscopicus液体培养中Pro-TGase出现在24h,在36h达到最高,之后Pro-TGase蛋白浓度逐渐下降。随着Pro-TGase蛋白浓度的降低,TGase蛋白浓度逐渐增加。与TGase蛋白浓度的增加相对应,TGase酶活力也开始增加。TGase酶活力在60h达到最高(2.4 U/mL),此时对应Pro-TGase的蛋白已全部转化为成熟酶TGase的蛋白。 2. S. hygroscopicus液体培养中,TGase活化蛋白酶分泌到胞外环境中并受抑制因子抑制。 TGase活化过程在无细胞上清液中发生沉默。在无细胞上清液培养过程中,从0至24h,Pro-TGase和TGase蛋白的浓度保持恒定,没有发生从Pro-TGase蛋白向TGase蛋白的转化;同时TGase活力保持恒定。10 mg/mL CTAB能够唤醒无细胞上清液沉默的TGase活化过程。添加CTAB的无细胞上清液中Pro-TGase蛋白明显的向TGase蛋白发生转化,同时对应着TGase活性的显著增加(从1.2 U/mL增加到2.3 U/mL)。 3. S. hygroscopicus液体培养中,TGase活化过程受多种蛋白酶催化调控。 通过DEAE-Sepharose F. F.柱纯化获得到了TAP样品。纯化的TAP样品(0.03 mg/mL)10μL加入到100μL Pro-TGase (0.26 mg/mL)中,30°C培养30min,TAP能够切割Pro-TGase获得TGase蛋白,同时可以检测到酶活从0提高到0.92 U/ml。纯化的TAP为丝氨酸蛋白酶。 无细胞上清液中TGase活化过程是多种蛋白酶参与的:包括丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。10 mmol/L的EDTA抑制下,无细胞上清液中TGase的酶活没有增加,Pro-TGase和TGase的电泳条带浓度也保持稳定;1 mmol/L的PMSF抑制下,TGase的酶活的增加以及Pro-TGase蛋白条带向TGase蛋白条带的转化过程明显滞后。 4. TAPI的纯化和鉴定及性质研究。 通过Fractogel EMD SO3-柱和Phenyl Sepharose 6 F. F.柱对TAPI进行纯化,TAPI的蛋白收率为6.36 mg/L。TAPI(0.4μg)能够抑制TAP(0.2μg)对Pro-TGase(2μg)的活化。 TAPI的N-端氨基酸序列为:GLYAATTALV,属于SSI蛋白家族。TAPI具有表面活性,在液体培养中主要分布在气液界面。5分钟内,TAPI (0.1 mg/mL)使水的界面张力从72降到60 mJ/m2。在此基础上,提出了基于TAPI界面分布的TGase活化过程调控模型。 5.在S. hygroscopicus固体培养中,TGase在菌体发生分化、形成气生菌丝时开始分泌和活化,并在形成孢子后停止活化,它可能参与了分化过程。 TGase在S. hygroscopicus营养菌丝的的生长阶段并不分泌,而是在开始生分化形成气生菌丝时才开分泌和活化,并在形成孢子后停止活化。48 h固体平板上开始出现白色的气生菌丝的同时,检测到胞外蛋白浸提液中TGase活性显著提高(0.51 U/plate);144 h固体平板上开始出现黑色孢子,此后已检测不到TGase活性。Pro-TGase当量活性在48 h开始出现(0.03 U/plate),之后逐渐升高并在菌体形成孢子后保持稳定(0.65 U/plate左右)。 胱胺能够抑制S. hygroscopicus液体培养种纯化到TGase的活性,25 mmol/L的胱胺可以抑制活性为0.17 U/mL的TGase 75 %的活性。25 mmol/L的胱胺能够显著延迟S. hygroscopicus的分化过程。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:TQ925

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