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《江南大学》 2007年
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癞葡萄降血糖肽的制备及其降糖机理研究

袁晓晴  
【摘要】: 癞葡萄(Momordica charantia L.Var.abbreviata Ser.,MCV)是葫芦科(Cucurbitaceae)苦瓜属的一个变种,原产于印度东部。由江苏省优质产品开发服务中心驯化改良而成,无锡富仁生物技术有限公司大面积栽培获得成功。现代药理研究证明苦瓜具有降血糖、降血脂、抗癌、抗艾滋病病毒、抑菌、抗氧化等功效。本论文以癞葡萄鲜果为原料,对癞葡萄水提物的降血糖活性进行了研究,并从中筛选出降血糖活性肽MC2-1-5。同时通过碱性蛋白酶Alcalase酶法水解癞葡萄蛋白制备具有降血糖活性的酶解物(MCPHs),并对MC2-1-5和MCPHs的降糖机理进行了研究,研究结果如下: 原料癞葡萄鲜果的化学组成为:水分92.28%,灰分0.48%,粗蛋白1.42%,粗脂肪0.93%,还原糖1.48%,多糖1.55%,粗纤维0.78%。以料水比、盐浓度、提取时间和提取温度为因素,以蛋白提取率为指标,通过正交实验确定癞葡萄水提物的最佳提取工艺条件。综合考虑成本、后续工作量等因素,确定提取条件为料液比1:2,盐浓度0.05 mol/L,提取时间4 h,提取温度40℃。对在此工艺条件下得到的水提物进行氨基酸组成分析,结果表明:水提物中含量最高的氨基酸为精氨酸,其次为谷氨酸和天门冬氨酸,含量分别为22.06%、9.75%、9.54%。三者约占水提物氨基酸总含量的41.35%。新鲜癞葡萄精氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸的含量依次为20.13%、12.51%和9.63%,三者约占癞葡萄水提物氨基酸总含量的42.27%。 通过四氧嘧啶型糖尿病小鼠研究了水提物的降血糖作用。结果表明不同剂量(250、500和750 mg/kg)的癞葡萄水提物可显著降低糖尿病小鼠的血糖浓度;水提物的降血糖作用在灌胃后2 h就已开始,并在4 h后达到最大。本实验中的最佳有效剂量为500 mg/kg,该剂量水提物比20 mg/kg剂量的格列本脲片产生的降糖效果更佳。然而,水提物对正常小鼠的血糖浓度不会产生显著影响。此外,水提物还可显著改善糖尿病小鼠的糖耐量。以500 mg/kg剂量连续治疗糖尿病小鼠15 d显著降低小鼠空腹血糖浓度,且和时间成正相关。到第15 d,血糖值较治疗前下降59.88%。水提物还显著增加糖尿病小鼠的体重、降低小鼠的采食量和饮水量。 以小鼠血糖浓度为指标,通过超滤、Sephadex G-25凝胶柱和半制备RP-HPLC从水提物中筛选降血糖肽。研究了进料流速、操作压力、操作温度和料液浓度对膜通量的影响。根据结果选择超滤条件:进料流速200 L/h、温度20℃、压力0.10 MPa、料液浓度20 g/L。超滤将癞葡萄水提物分成浓缩液(MC1)和透过液(MC2)两个组分,动物实验表明MC2对糖尿病小鼠血糖浓度有显著影响,在灌胃2 h和4 h后使小鼠血糖浓度降低46.15%和52.59%。而MC1对血糖浓度影响不显著。 Sephadex G-25凝胶色谱柱将MC2分成六个组分,动物实验表明MC2-1在以20 mg/kg剂量灌胃时即可显著降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠的血糖浓度,在灌胃2 h和4 h后使小鼠血糖浓度降低47.43%和51.87%。其他组分对小鼠血糖浓度无显著影响。用半制备RP-HPLC柱将MC2-1分成十个组分,动物实验表明组分MC2-1-1和MC2-1-5在以2 mg/kg剂量灌胃时即可显著降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠的血糖浓度。与相应的初始血糖值相比,MC2-1-1在灌胃2 h和4 h后分别使小鼠血糖降低43.84%和54.57%;MC2-1-5在灌胃2 h和4 h后分别使小鼠血糖降低61.70%和69.18%。其他组分对小鼠血糖浓度无显著影响。MC2-1-5还可显著改善小鼠的糖耐量。 红外光谱图显示多肽MC2-1-5在500~4000 cm~(-1)范围具有肽的特征吸收峰。串联飞行时间质谱仪测得MC2-1-5的相对分子质量为3405.5174。蛋白测序仪测得MC2-1-5的N端前10个氨基酸残基排列次序为GHPYYSIKKS。 癞葡萄水溶性蛋白不具备降血糖功效,为充分利用这部分蛋白,酶解癞葡萄蛋白制备降血糖酶解物。以水解度、蛋白回收率和MCPHs的降血糖活性为指标,从六种蛋白酶中选出碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解癞葡萄蛋白。通过单因素试验和响应面分析确定Alcalase水解癞葡萄蛋白的最佳工艺条件:[E]/[S]2.37、pH9.2,温度57℃。在此工艺条件下制备了三种不同DH的MCPHs(8.5%、11%和13.5%),动物实验表明DH为8.5%的MCPHs不具备降血糖活性,DH为11%和13.5%的MCPHs都具有显著的降血糖活性,而DH为11%的MCPHs的降血糖活性高于DH为13.5%的降血糖活性。 根据吸附和解吸效果选择DA201-C大孔吸附树脂对MCPHs进行脱盐。脱盐后MCPHs的含量从脱盐前的76.67%提高至脱盐后的85.69%;MCPHs的回收率为78.38%。脱盐率为92.49%。脱盐后的MCPHs仍有显著的降血糖作用,且降血糖作用较脱盐前稍有提高。 研究了MC2-1和MCPHs的降血糖机理。经MC2-1和MCPHs治疗28 d后,与模型对照组相比,糖尿病小鼠体重显著上升;采食量和饮水量显著下降;脏器/体重比恢复至接近正常水平;空腹血糖值下降;糖耐量显著改善;肝糖原含量显著增加。经MC2-1治疗的糖尿病小鼠的血清胰岛素水平显著提高,但经MCPHs治疗的糖尿病小鼠的血清胰岛素水平未见显著改善。 经MC2-1和MCPHs治疗28 d后,小鼠血清FFA、TC、TG和LDL-C水平下降;HDL-C水平上升,说明MC2-1对糖尿病所引起的高血脂症有一定的治疗作用;小鼠MDA含量下降,SOD活性和GSH-Px活性上升,说明MC2-1和MCPHs能够改善糖尿病小鼠体内的氧化应激机制和提高其抗氧化能力。胰腺、肝脏和肾脏组织形态观察表明MC2-1和MCPHs能改善四氧嘧啶对这些器官细胞造成的损伤。 上述结果表明MC2-1的降糖机理是修复糖尿病小鼠胰岛β细胞、促进胰岛素分泌、增加肝糖原含量及提高小鼠抗氧化能力;MCPHs的降糖机理是修复糖尿病小鼠胰岛β细胞,增加肝糖原含量及提高小鼠抗氧化能力。由于MC2-1-5是MC2-1中的主要降血糖组分,因而推测MC2-1-5的降糖机理与MC2-1类似。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R151

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