收藏本站
《江南大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的制备、性质及应用研究

沈汪洋  
【摘要】: α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase,α-D-Galactoside galactohydrolase,α-Gal; EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶。来源于咖啡豆的α-半乳糖苷酶具有将半乳糖转移到环糊精上的功能,从而酶法合成α-半乳糖基-环糊精。α-半乳糖基-环糊精是一种分支环糊精,具有广阔的应用前景。本文从发芽咖啡豆中分离纯化得到α-半乳糖苷酶,详细研究了该酶的酶学性质,酶法合成了α-半乳糖基-β-环糊精,并确定其结构。 以培养35d的发芽咖啡豆为原料,冷冻24h(-40℃)后干法粉碎,提取液(水溶液:含有0.9%氯化钠,0.1mmol/L乙二胺四乙酸,pH4.8)粗提α-半乳糖苷酶。其它条件:料液比1:5,时间30min,搅拌速度100r/min。此条件下得到的α-半乳糖苷酶总酶活为132.60nkat,比酶活为6.44nkat/mg。采用响应面分析法优化粗提条件,优化后的条件:料液比1:5,时间35min,搅拌速度150r/min,pH 5.0。此条件下α-半乳糖苷酶总酶活为148.00nkat,比酶活为7.16nkat/mg,总酶活和比酶活都得到提高。α-半乳糖苷酶提取过程中,植物多酚造成严重的干扰,必须去除此物质。采用50%(V/V)丙酮去除粗提液中的植物多酚,去除率为76.4%,效果明显。去除植物多酚后,α-半乳糖苷酶总酶活为129.05nkat,比酶活为8.26nkat/mg。总酶活有所降低,但比酶活显著提高,有利于α-半乳糖苷酶的分离纯化。 通过硫酸铵沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephacryl S-200-HR凝胶过滤色谱等分离纯化技术,从发芽咖啡豆粗酶液中分离得到α-半乳糖苷酶。经过变性凝胶电泳分析,该酶出现单一谱带,分子量为38,805Da。经过分离纯化之后,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活达到191.50nkat/mg,纯化倍数为23.18倍。 以对硝基苯酚-α-半乳糖苷为底物,研究分离纯化后的发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的酶学性质。α-半乳糖苷酶的最适温度45℃,热稳定温度范围20-50℃,最适pH6.0,pH稳定范围5.0-7.0。Na+、K+、Mg2+和Cu2+对α-半乳糖苷酶的酶活影响不大,Zn2+促进酶活,Ba2+对酶活稍有抑制,Hg2+强烈抑制α-半乳糖苷酶的活性。在0-0.25mol/L离子强度(氯化钠)范围内,α-半乳糖苷酶的酶活不受影响。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法,测定α-半乳糖苷酶的Km为0.556mmol/L,Vmax为1.19μmol/min。一定浓度条件下,化学修饰剂对α-半乳糖苷酶的化学修饰结果显示:色氨酸是α-半乳糖苷酶活性中心的必需氨基酸,-SH、-COOH和组氨酸对α-半乳糖苷酶的活性有影响,精氨酸、赖氨酸和-S-S-不是α-半乳糖苷酶活性中心的必需基团。邹氏作图法显示α-半乳糖苷酶活性中心的必需色氨酸数目为1。 采用发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成分支环糊精。以蜜二糖(0.8mol/L)为供体,β-环糊精(0.4mol/L)为受体,反应缓冲液为醋酸缓冲液(50mmol/L, pH6.0),α-半乳糖苷酶用量为50nkat。反应条件:温度30℃,时间36h,振荡速度100 r/min。反应结束后,产品的高效液相色谱分析表明:有β-环糊精的衍生物生成。通过制备型高效液相色谱分离得到纯化样品。经过质谱分析和样品酶解产物的高效液相色谱分析,确定该样品为单取代的α-半乳糖基-β-环糊精。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振分析,得出α-半乳糖基-β-环糊精的结构:一个半乳糖通过α-1,6糖苷键与一个β-环糊精连接。α-半乳糖基-β-环糊精为单取代-6-O-α-D-半乳糖(吡喃)基-β-环糊精。 通过发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精动力学研究可以得到合适的参数:pH6.8,酶用量60nkat,β-环糊精0.4mol/L,蜜二糖0.8mol/L。由Plackett- Burman设计筛选出酶用量,时间和pH这三个影响α-半乳糖基-β-环糊精产量的主要因素。进一步通过最陡爬坡法和Box-Behnken设计,得到酶用量,时间和pH的最佳水平分别为73nkat,28h和6.3。其它条件:温度40℃,振荡速度75r/min,β-环糊精0.4mol/L,蜜二糖0.8 mol/L,反应体系为2mL醋酸缓冲液(50mmol/L)。在此条件下,α-半乳糖基-β-环糊精产量为28.4%,比优化前提高了41.3%。
【学位授予单位】:江南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:TQ925

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 沈汪洋;金征宇;;发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的性质研究[J];安徽农业科学;2011年19期
2 沈汪洋;金征宇;;从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶的研究[J];安徽农业科学;2011年16期
3 沈汪洋;金征宇;;半乳糖基-β-环糊精的合成与结构研究[J];食品科学;2011年12期
4 董岩岩;张燕婕;黄遵锡;周峻沛;唐湘华;李俊俊;;产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、鉴定及其酶学特性的研究[J];饲料工业;2011年14期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘彩琴;阮晖;傅明亮;陈启和;何国庆;;提高α-半乳糖苷酶稳定性的研究[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
2 刘彩琴;何国庆;陈启和;王伟;杨潞芳;阮晖;李青青;;一株产α-半乳糖苷酶菌的分离与选育[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
3 刘彩琴;阮晖;傅明亮;周兵;陈启和;何国庆;;α-半乳糖苷酶的液体发酵条件和酶学性质研究[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
4 刘彩琴;何国庆;;臭曲霉_(ZU-G1) _(α-)半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
5 常毅娜;鞠现霞;崔琴;王坤林;周红文;;α-半乳糖苷酶A活性检测及临床意义[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
6 范树泉;赵晗;卢丽丽;肖敏;;定向进化技术提高α-半乳糖苷酶的转糖基效率[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
7 成廷水;呙于明;冯定远;;α-半乳糖苷酶在饲料中的研究与应用[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年
8 乔伟;周利芬;戴求仲;周辉;;α-半乳糖苷酶在禽料中的应用研究进展[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
9 周荣荣;吴沙利;;α-半乳糖苷酶对几种饼粕饲料的体外消化分析[A];饲料酶制剂的研究与应用[C];2009年
10 章扬培;季守平;杨军;宫锋;任会明;刘泽澎;李素波;;血型改造制备通用血[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 何国庆 张灏;新酶种的开发和酶性能的改善(上)[N];中国食品报;2009年
2 上海交大医学院附属瑞金医院 潘晓霞 陈楠;“重男轻女”的法布雷氏病[N];健康报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 沈汪洋;发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的制备、性质及应用研究[D];江南大学;2009年
2 王春林;α-半乳糖苷酶固态发酵中试技术参数研究[D];中国农业大学;2005年
3 张梁;基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母[D];江南大学;2005年
4 徐莉娟;诊治法布莱氏病的单抗及重组蛋白的研制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
5 曹雅男;微生物来源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆与性质研究[D];中国农业科学院;2008年
6 王萍;肥厚型心肌病基因与表型关系研究[D];中国协和医科大学;2006年
7 郭钦;食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建[D];浙江大学;2009年
8 张衡;不同亚型流感病毒NS1与PSD-95相互作用及对神经元NO的影响[D];汕头大学;2011年
9 周峻沛;云斑天牛胃肠道内共生细菌来源的纤维素酶和半纤维素酶的初步研究[D];中国农业科学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王奎山;黄瓜(Cucumis sativus L.)α-半乳糖苷酶基因启动子的克隆及序列分析[D];扬州大学;2010年
2 贲培培;α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究[D];南京农业大学;2011年
3 周晶辉;一株产α-半乳粮苷酶细菌的筛选、鉴定及酶基因克隆分析[D];湖南农业大学;2011年
4 何友文;一株嗜酸真菌的分离鉴定及其两种苷酶的酶学性质[D];南昌大学;2011年
5 王慧;来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究[D];中国农业科学院;2010年
6 刘泽澎;B→O血型改造动物实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
7 徐晓锋;黄瓜α-半乳糖苷酶基因克隆及表达分析[D];扬州大学;2006年
8 马静静;黄瓜4种α-半乳糖苷酶的Southern杂交及表达分析[D];扬州大学;2008年
9 唐香山;α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌与酵母中的表达[D];湖南农业大学;2005年
10 汤雪燕;绿色荧光蛋白融合表达法研究黄瓜α-半乳糖苷酶亚细胞定位[D];扬州大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026