米糠谷氨酸脱羧酶的分离纯化及其性质研究

【摘要】： γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作为一种非蛋白质氨基酸,具有许多重要的生理功能,谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC 4.1.1.15)可催化L-谷氨酸脱羧生成GABA,利用植物内源性GAD制备GABA是一个很好的途径。研究发现,米糠具有较高的GAD活力。本论文从米糠中分离纯化得到GAD和对其活性有重要意义的钙调素(calmodulin,CaM),对它们的结构和性质进行研究,探讨米糠中GAD的活性调节机制,为进一步利用米糠GAD富集制备GABA提供理论基础。 论文首先研究了植物组织中GAD活力的测定方法。建立了2,4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生反相高效液相色谱-紫外检测法测定植物中GAD活力的方法。利用GAD催化L-谷氨酸脱羧转变成GABA的性质,用FDNB柱前衍生GABA,HPLC Lichrospher C18色谱柱分离,在360nm下检测衍生物,从而得到生成GABA的含量,及不同植物组织中的GAD活力。该方法的线性范围0.2-5mg/mL GABA(R2=0.9954),精密度高(RSD=0.061%),回收率高,且衍生化产物在一个月内都能保持稳定。本方法成功地应用于几种植物组织的GAD活力测定。结果显示,米糠具有相对较高的GAD活性,利用廉价易得的米糠制备GABA具有良好的前景。 在对粗提物进行(NH4)2SO4分级沉淀后,分别采用色谱方法(包括:DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、HW-55F体积排阻色谱和Superdex 200凝胶过滤色谱)和Native-PAGE法分离纯化得到了米糠中两种GAD同工酶:RbGADL1和RbGADL3。SDS-PAGE结果显示为单一条带,根据Rf值计算得到其相对分子质量分别为:7.3万和4.7万,质谱(MS)法测得RbGADL1和RbGADL3的相对分子质量分别为139113.97和46985.65。推测RbGADL1是由两个相对分子质量约70000的亚基组成的,而RbGADL3不含有亚基。本论文选择回收率较高的RbGADL3进行结构和性质方面的研究。 分别用肽指纹图谱法(PMF)和肽序列标签技术(PSI)对RbGADL3进行鉴定,结果显示其与Os01g0926300的肽指纹图谱最为相似,肽段覆盖率为22.69%。PSI-BLAST同源性分析表明RbGADL3与Os03g0113700(Oryza sativa(japonica cultivar-group))和OsI_09713(Oryza sativa Indica Group)同源性较高。通过紫外-可见、荧光、圆二色(CD)光谱、傅立叶转换红外光谱(FT-IR)、拉曼光谱(Raman)等光谱学性质研究,并结合生物信息学预测方法,得到了RbGADL3二级结构的大致范围:α-螺旋含量约为30%-45%;β-折叠含量约为10%-20%,β-片层含量约为10%-30%,无规卷曲含量约为30%-60%。用同源模拟法和折叠识别模拟方法来预测RbGADL3的空间结构,得到了RbGADL3大致的结构模型。 利用Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析一步纯化得到了米糠中的CaM:RbCaM,纯化倍数为851.7,比活力7.66U/mg,回收率为55.6%。MS测定RbCaM的相对分子质量17221.89,氨基酸分析结果显示,RbCaM中酸性氨基酸含量丰富,碱性氨基酸的比例较低,不含色氨酸。 分别用PMF法和PSI法对RbCaM进行鉴定,得到相同的结果为Os03g0699000(oleosin,Oryza sativa Japonica Group),为来源于稻米的一种储存蛋白质。并研究了Ca2+存在与否两种情况下RbCaM的紫外-可见、荧光和CD光谱性质,发现RbCaM结合Ca2+前后结构发生了很大的变化,并通过CD光谱研究其二级结构。与生物信息学方法结合,推断出RbCaM二级结构的大致范围:α-螺旋含量约为30%-50%;β-折叠含量约为0%-10%,β-片层含量约为0%-30%,无规卷曲含量约为27%-44%。在同源模拟法预测RbCaM三级结构失败的情况下,通过折叠识别模拟方法识别到以下几个折叠区域模型:Neurotransmitter-gated ion-channel transmembrane por(e神经传递离子通道转膜孔)、Transmembrane helix hairpin(转膜发卡螺旋)、Ribosomal protein L13(核糖体蛋白L13)和Signaling protein(信号传递蛋白)。PredictProtein服务器预测结果显示,RbCaM为一个结构致密的球状蛋白质。位点比对搜索结果显示,RbCaM可能具有以下三个位点:Protein kinase C phosphorylation site、N-myristoylation site和Oleosins signature。 研究了RbGADL3的酶学性质以及RbCaM对RbGADL3活力的调节作用,发现RbCaM对RbGADL3起激活作用,在Ca2+存在条件下,激活作用大大提高。并且发现主要起激活作用的是Ca2+,而不是其他金属离子。证明RbGADL3也是一种钙调素结合蛋白,而且是一种Ca2+依赖的CaMBP,其活性受Ca2+调节。在Ca2+浓度为0.23mmol/L条件下,1mg RbGADL3的半激活RbCaM量为6μg。 优化了利用米糠内源GAD富集制备GABA的工艺。得到最佳富集条件:反应时间6h,0.08mol/L的磷酸盐缓冲液,PLP浓度2mmol/mol谷氨酸钠(MSG),Ca2+浓度20mmol/mol MSG,米糠用量500g/molMSG。该条件下GABA的生成量为2.3g/100g米糠,这个含量是其本身所含有GABA的45倍。并利用海藻酸钠固定化米糠GAD,制备出操作稳定性和贮存稳定性都比未固定米糠(FRB)大大提高的固定化米糠(IRB),设计了连续化生产GABA的工艺,为GABA的制备提供了新的途径。在最佳条件下反应60h后,GABA的产量25.98mg/g米糠,比FRB法GABA产量高12.95%。在通过IRB法制备的反应液中,蛋白质和总糖的含量比FRB法大大降低,这为GABA的分离纯化提供了方便。