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提高重组E.coli产胆固醇氧化酶水平的研究

王长城  
【摘要】: 胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6 COD)在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们的重视,并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究产COD重组E.coli的发酵优化,目的提高产酶水平。 在摇瓶中优化了重组E.coli JM109的发酵培养基、诱导条件以及环境条件。结果表明,起始甘油浓度10mL/L;起始胰蛋白胨和酵母粉浓度分别为10g/L和5g/L;并在早期添加0.3mmol/L的IPTG诱导6h;以摇床转速180r/min、装液量15%、起始pH7.5、培养温度37℃以及5%的接种量为培养条件;使得摇瓶中产酶水平达到1686.57U/L。为优化前700U/L的2.4倍。 研究不同的底物流加方式,实现重组E.coli的高密度培养。研究发现恒pH-stat法虽然可以获得较高的菌体干重42.68g/L(DCW),但是其发酵周期长(36h),不利于生产强度的提高;分段指数流加策略,实现了短时间内菌体的高密度培养,DCW在第14h达到40.13g/L。对高密度培养中诱导时机的优化中发现,均在发酵中期诱导效果佳,使得菌体产酶水平达到6436.56U/L,生产强度达到459.75U/(L?h),实现了重组E.coli产COD的高效表达和高效生产的统一。为优化前700U/L的9.2倍。 研究以廉价无毒的乳糖代替昂贵有毒的IPTG,诱导重组E.coli表达COD的实验中发现,乳糖一方面可以作为碳源供菌体生长,另一方面又可以诱导外源基因的表达。研究中还发现在添加乳糖诱导时,菌体对乳糖有个大约10h适应期。以复合流加碳源基质(甘油和乳糖),诱导重组E.coli表达COD的研究中发现该方法并没有消除菌体对乳糖的适应期,但是采用恒pH-stat法的流加策略,克服了因适应期的长期饥饿而产生的负面影响,使得产酶水平达到6005.66U/L,为IPTG诱导的93.3%,生产强度为200.19U(L·h),为IPTG诱导的47.4%。


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