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凝结芽孢杆菌发酵产L-乳酸及其代谢纤维二糖机制的研究

周洁  
【摘要】:廉价的木质纤维原料发酵制备乳酸可以有效降低现今工业乳酸的生产成本,是未来工业乳酸发展的新方向。本论文首先探讨了亚硫酸盐蔗渣浆的酶解性能及条件。并以凝结芽孢杆菌为发酵菌株,研究了同步糖化发酵产乳酸的工艺条件并在高底浓下对同步糖化发酵工艺进行了优化和放大。基于首次发现该菌株同步糖化发酵时无需添加葡萄糖苷酶,本论文还初步探讨了凝结芽孢杆菌代谢纤维二糖的机制,为木质纤维原料的高效利用打下基础。所选原料亚硫酸盐蔗渣浆纤维素、半纤维素及木质素的含量分别为73.84%、14.33%和5.93%。在纤维素酶(celluclast 1.5L)用量为15 FPIU/g纤维素,β-葡萄糖苷酶(Novozyme188)用量为7.5 pNPGU/g纤维素条件下酶解底浓为80 g/L的亚硫酸盐蔗渣浆,反应72 h,可得到50 g/L的葡萄糖和9.5 g/L的木糖,酶解得率为61.45%;以凝结芽孢杆菌CC17为发酵菌株直接进行亚硫酸盐蔗渣浆同步糖化发酵,结果表明凝结芽孢杆菌发酵培养基最佳氮源为YE 2.5 g/L、玉米浆干粉1.2 g/L和硫酸铵5 g/L;同步糖化发酵过程不需要添加β-葡萄糖苷酶;木聚糖酶的添加可有效提高乳酸产量。60 g/L亚硫酸盐蔗渣浆在纤维素酶用量为10 FPIU/g纤维素,木聚糖酶用量为120 U/g半纤维素条件下发酵72 h可以产生56 g/L的乳酸。分批补料可有效缓解高底物浓度下同步糖化发酵过程中因液化困难造成的乳酸产量难以提高的问题。初底浓为60 g/L,在36 h补进含6 g绝干纤维素的底物,最终底物纤维浓度为98.86 g/L。10 FPIU/g纤维素的纤维素酶、120 U/g半纤维素的木聚糖酶与50%的碳酸钙随着底物一起加入到培养基中。发酵144 h后乳酸产量达到69.2 g/L,转化率为0.70g/g纤维素。以尤特尔公司的纤维素酶代替celluclast 1.5L可生产类似的乳酸产量。当补料初底浓为30 g/L,一次性加入所有酶液与碳酸钙,48 h内连续7次补进含3 g绝干纤维素的底物,最终153.3 g/L的底物纤维素可产生110 g/L的乳酸,产率达0.72 g/g纤维素。利用3L发酵罐进行补料分批发酵的放大实验,补料初底浓与补料浓度均为45 g绝干纤维素,48 h内连续补料5次,发酵192 h后乳酸产量达到102.8 g/L,产率可达0.80 g/g底物纤维素。凝结芽孢杆菌CC17能有效地降解利用纤维二糖,当纤维二糖浓度为40 g/L时,糖酸转化率可达89.70%。对凝结芽孢杆菌纤维二糖的降解机制探索表明,凝结芽孢杆菌CC17胞内检测不到β-葡萄糖苷酶的酶活,但其基因组内假定蛋白BCBGL1具有6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的酶活,且活力与纤维二糖诱导呈正相关。基因组显示凝结芽孢杆菌存在两条潜在的纤维二糖操纵子,且第一条操纵子包含完整的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶和PEP-PTS转运蛋白,在纤维二糖存在下高水平表达。因此,本论文首次确定了凝结芽孢杆菌体内存在一条假定的纤维二糖代谢路径,即含有纤维二糖PTS转移系统和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(将6-磷酸-纤维二糖降解为葡萄糖和6-磷酸-葡萄糖)。


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