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氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化木糖酸关键性抑制物的分子响应机制

缪园园  
【摘要】:本论文针对氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans NL71)全细胞原位催化木质纤维原料稀酸水解液合成木糖酸的抑制问题,测试并筛选出三种典型抑制物甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛,研究了它们对木糖酸全细胞催化抑制的反应动力学。基于高通量测序技术测定G.oxydans NL71的全基因组,以此为对照建立三种抑制物物条件下的全细胞催化木糖合成木糖酸的特征转录谱,通过RQ-PCR分析解析抑制物响应的关键基因并探索其分子调控机制。研究结果表明,甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛是氧化葡萄糖酸杆菌全细胞原位催化木质纤维原料稀酸水解液合成木糖酸的主要抑制物。5 g/L甲酸、8 g/L糠醛、3 g/L对羟基苯甲醛单独存在时即对细胞催化性能产生明显的抑制毒性,导致木糖利用速率和木糖酸产率显著下降。基于木质纤维原料木糖氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化制取木糖酸的生产水平分析,甲酸抑制作用最为明显,其次为糠醛和对羟基苯甲醛。基于Hiseq 2500和Miseq测序平台完成G.oxydans NL71基因组测序工作并提交至NCBI(编号LCTG00000000)。G.oxydans NL71基因组大小为3.25 Mb,GC含量55.71%,含有编码基因3226个,非编码基因(59个tRNA,5组rRNA),基因岛11个,前噬菌体3个。G.oxydans NL71基因组基因功能注释分析,GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot、TrEMBL注释得到的结果分别为1124、1758、1600、3012、1161和2964。采用Hiseq 2000高通量测序平台测定在甲酸、糠醛和对羟基苯甲醛条件下氧化葡萄糖杆菌全细胞催化木糖合成木糖酸的的转录组。通过与空白对照比较研究,在分子转录水平上分别获得甲酸、糠醛、对羟基苯甲酸响应的目标基因572、714和408个。结合实时转录PCR验证进一步筛选得到19个主要的抑制物响应基因,主要包括:糖酵解途径的甘油醛3-磷酸脱氢酶(NL71GM001713),三羧酸循环的2-酮戊二酸脱氢酶(NL71GM001355),磷酸戊糖途径的核糖5-磷酸异构酶(NL71GM001290),细胞转运系统和分泌系统的蛋白(NL71GM001291、NL71GM001292、NL71GM000616、NL71GM002123),细菌化学趋向性蛋白(NL71GM000741、NL71GM000736),电子传递的硫氧化还原蛋白(NL71GM000876)、NAD(P)转氢酶组成亚基(NL71GM002001)、乙醇脱氢酶(NL71GM001165)、铁氧化还原酶(NL71GM000337)、单硫基谷氧还蛋白(NL71GM002512),细胞脱毒作用的过氧化物氧化还原酶(NL71GM001610)、烷基过氧化氢还原酶(NL71GM001611)、谷肽甘肽过氧化物酶(NL71GM000375)、超氧化物岐化酶(NL71GM002096)和细胞色素c过氧化物酶(NL71GM000364)。在此基础上,结合细胞生理生化和代谢流探讨了上述差异基因所对应的生物学功能。


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