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《南京林业大学》 2017年
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簸箕柳基因组测序及功能基因研究

戴晓港  
【摘要】:植物全基因组测序是进行基因功能解析、研究基因表达调控和开展基因图位克隆的重要研究平台。毛果杨全基因组测序组装的完成使杨树成为木本植物研究的模式树种。但是杨树世代周期长,一般6~7年才能开花,且个体高大,作为木本植物的模式仍存在明显缺陷。而簸箕柳是原产我国的当年开花小灌木,是杨树的姊妹种,其个体小、更易于无性繁殖,容易开展大规模田间实验,且存在丰富的自然变异,是木本植物遗传研究的理想材料。论文开展了簸箕柳的全基因组测序,获得主要研究结果如下:1、采用全基因组鸟枪法完成了簸箕柳全基因组从头测序,共获得16.5倍覆盖度的454GS FLX单末端序列和7.3倍覆盖度的3 kb、8 kb和20 kb插入片段的双末端序列,231.1倍的插入片段为200 bp和500 bp的Illumina双末端序列。以454 GS FLX测序序列拼接得到了簸箕柳基因组序列骨架,采用Illumina双末端序列进行补洞,最终得到303.8 Mb的基因组序列,scaffold N50长度为925.0 kb,contig N50为17.4 kb,覆盖基因组总长的71.5%。对簸箕柳基因组进行质量评估发现:基因组超过94.0%的碱基测序深度大于20倍,拼接的基因组序列覆盖了簸箕柳97.6%Unigene和其他柳树94.2%的EST序列,以及97.8%核心真核生物基因,上述结果表明簸箕柳基因组拼接质量较高。2、采用De novo、同源注释和RNA-seq依赖的方法进行基因注释,共得到26,599个蛋白质编码基因,其基因数量比毛果杨少13,000个。将注释的基因比对到nr、Swissprot、TrEMBL等蛋白质数据库进行功能注释,发现25,871个基因在蛋白质数据库中有同源序列,占注释基因总数的97.3%。结合De Novo和同源注释两种方法,分别在核酸和蛋白质水平鉴定基因组中的重复序列,共得到125.6 Mb的非冗余重复序列,约占拼接基因组的41.4%。此外还注释得到了829个tRNA基因,161个rRNA基因和598个snRNA基因。3、利用流式细胞仪测定簸箕柳基因组大小为429.3 Mb。采用40倍覆盖度的高质量Illumina序列进行17 K-mer分析,得出簸箕柳基因组大小为425.0 Mb。上述结果说明簸箕柳与杨树虽是近缘物种,但其基因组要比毛果杨小约60 Mb。4、比较基因组发现簸箕柳和毛果杨基因组存在广泛的共线性和相似性,且两物种基因组内部共线性区域同源基因对之间的4DTv值基本相似,这一结果表明簸箕柳和毛果杨一样,也经历了‘Salicoid’复制事件。通过计算估测,发现这次全基因组复制事件发生在距今约58.08±0.11百万年,在全基因组复制事件发生之后六百万年,杨树和柳树分化开来。5、对簸箕柳和毛果杨基因的复制和保留方式分析发现,毛果杨中全基因组复制和片段复制基因的比例较簸箕柳高,说明毛果杨保留了较多的‘Salicoid’复制的基因。在某些杨柳共有的基因家族中,即使簸箕柳中该基因家族包含的基因数目比毛果杨多,其全基因组复制和片段复制的比例也比毛果杨低,推测簸箕柳的基因扩张主要源自于串联复制和转座复制。6、通过计算簸箕柳、毛果杨、葡萄、拟南芥和水稻中1,232单拷贝直系同源基因碱基替换速率,得到簸箕柳和毛果杨基因组碱基替换速率分别为1.09×10-9和0.67×10-9/site/year。结果还显示,木本植物替换速率显著低于草本植物,短生殖周期木本植物的进化速率比长生殖周期的快。7、采用Illumina Hi-Seq 4000测序平台,完成了簸箕柳雌花授粉后不同时间的转录组测序。序列拼接共得到32,367条unigenes序列,序列总长度53.6 Mb,contig N50长度为2,275 bp。对簸箕柳转录组拼接序列所含微卫星序列进行了分析和查找,构建了簸箕柳转录组微卫星引物数据库。8、通过对雌花序授粉后不同时间转录组差异表达分析,共得到927个差异表达基因。GO富集分析发现,授粉144 h后上调表达的257个基因主要富集到糖基转移酶、钙离子结合和ATP结合等生物功能分类中。控制纤维素合成的CesA基因属于糖基转移酶家族,钙离子也直接影响棉花纤维的形成,上述富集的基因为调控簸箕柳柳絮发育提供了重要信息。
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S793.9

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