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《南京林业大学》 2017年
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星天牛高致病力绿僵菌菌株筛选、应用及免疫响应的转录组分析

蔡守平  
【摘要】:星天牛Anoplophora chinensis(Forster)是东南沿海木麻黄防护林的主要蛀干害虫,属全国林业危险性有害生物。其寄主广泛,以幼虫蛀食近地的主干或主根,破坏树体养分和水分的运输,导致树势衰弱,重者整株枯死。该虫在福建木麻黄沿海防护林中大面积发生,一般林分有虫株率为20~30%,危害严重的高达80%以上,大大削弱了防护林的防护效能。以往星天牛的防治主要是化学药剂防治为主,由于天牛成虫的羽化期较长、幼虫危害隐蔽,化学药剂难以长时间控制,防治效果不甚理想。绿僵菌Metarhizium spp.是应用最为广泛的杀虫真菌之一,由于具有良好的传播效果、较长的林间宿存能力、不易导致害虫抗性以及容易生产等优点,在农林害虫的防治中发挥了重要作用。本文通过星天牛幼虫人工饲养、星天牛高致病力菌株筛选及评价、绿僵菌培养及林间应用等方面的系统研究,为利用绿僵菌防治木麻黄沿海防护林星天牛危害提供技术依据,同时应用RNA-Seq技术对星天牛幼虫感染绿僵菌后的免疫响应相关基因进行了分析。本文主要结果如下:1、通过3年、4种不同配方人工饲料星天牛连续继代饲养,比较人工饲料配方和温度条件对饲养效果的影响,结果表明:星天牛在4种不同配方的人工饲料上均可完成生活史,饲养出成虫能正常交配产卵,孵化的幼虫能在人工饲料上继续完成发育;但化蛹率、羽化率在不同饲料上差异显著,以含有木麻黄锯屑和麦麸的Diet A和Diet D饲养效果较好。应用Diet A饲养,第1、2、3代(持续3年)幼虫化蛹率分别为100%、90%和95%,蛹羽化率分别为100%、83%和90%;应用Diet D,第1、2、3代化蛹率分别为87%、78%和87%,羽化率分别为87%,67%和80%,而Diet B和C上饲养的幼虫化蛹率和羽化率较低。室温下饲养的化蛹率和羽化率较恒温条件(25℃和28℃)下高,且化蛹和羽化时间较整齐(均在4~5月,与林间观察一致),说明变温对星天牛化蛹时间有显著影响,在发育过程中低温的存在显著提高了星天牛幼虫的化蛹率和促进化蛹、羽化的一致性。2、金龟子绿僵菌不同菌株菌落生长速度、产孢量及其对星天牛的致病力测定表明:不同菌株生长速率和产孢量间存在显著差异,MaZPTR-01菌株生长速度较快、产孢量较高,在PPDA培养基上培养15 d后菌落直径达5.9 cm,产孢量为1.1×108孢子/cm2。不同绿僵菌菌株对星天牛幼虫的致病力也存在显著差异,接种20 d后,星天牛幼虫累积死亡率在40%~96.7%之间;MaZPTR-01菌株对星天牛幼虫致死速度快,致死率达到96.7%,僵虫率达到86.7%,显著较其它菌株高,致死中时(LT50)为5.71 d,显著较其它菌株短。此菌株可作为优良菌株用于星天牛的防治。3、运用时间-剂量-死亡率模型分析了绿僵菌MaZPTR-01菌株对星天牛幼虫的致病力,结果表明:使用不同浓度的孢子悬浮液接种,星天牛幼虫死亡率随着孢子浓度的增加和作用时间的延长而增大,1.0×109、1.0×108孢子/mL浓度的绿僵菌孢子悬浮液处理7 d和9 d后,幼虫累积死亡率均达到100%;用1.0×107、1.0×106、1.0×105孢子/mL浓度处理15 d后,累积死亡率分别为93.3%、70.0%和56.7%。LD50和LD90随接种处理后时间的增加而降低,剂量效应逐渐增强。LT50随处理的孢子悬浮液浓度增加而减小,时间效应逐渐增强。不同龄期幼虫接种处理后的死亡速度、LT50和LT90随着龄期的增加而延长,初孵(1龄未取食幼虫)、1龄、2龄、3龄、4龄幼虫的LT50分别为2.46 d、4.53 d、4.39 d、5.82 d和8.92 d,绿僵菌对3龄以前的幼虫致病力较强。4、对星天牛高致病力菌株MaZPTR-01的发酵条件研究表明:MaZPTR-01菌株的最佳固体发酵培养基为玉米粉1份、麦麸3份、米粉1份、谷壳3份(按体积份计)。固体培养基加水后灭菌的处理组,绿僵菌产孢量显著高于先灭菌后加无菌水的处理组。每500g固体培养基加水400m L混合后灭菌处理,基质的物理状态好、产孢量最高。固体培养基厚度以5cm培养效率最好。应用绿僵菌MaZPTR-01菌株相关菌剂进行的林间防治试验表明:林间星天牛成虫接触绿僵菌菌条13 d后,死亡率达100%,LT50为5.93 d,天牛成虫平均存活期为7.1 d,显著地低于对照的26.1 d,显示菌条在林间对星天牛成虫具有较高的侵染效率。幼虫防治试验表明,星天牛幼虫虫龄越小、蛀道越短,喷孢子悬浮液的防治效果越好,初孵幼虫期进行喷菌处理,木段中的幼虫死亡率超过90%。使用绿僵菌菌条与喷菌液处理结合的方式进行防治,木麻黄林分有虫株率仅为5.3%,较对照组(38.9%)下降了86.3%,具有推广应用价值。5、通过RNA-Seq转录组测序技术对健康的(CK)及被绿僵菌MaZPTR-01菌株侵染12h(Ma12)、24h(Ma24)和36h(Ma36)的星天牛幼虫进行了转录组测序分析,筛选了差异表达基因,并利用生物信息学工具对差异表达基因进行了功能注释、分类和参与的信号通路分析,结果表明:与de novo拼接获得的星天牛基因组相比,Ma12样本有3487个差异基因(上调基因有2284个,下调基因有1203个);Ma24有3476个差异基因(上调基因2265个,下调基因1211个);Ma36样本差异基因有4440个(上调基因3067个,下调基因有1373个)。不同时段差异基因进行了GO注释分析发现,Ma12共1756个差异基因(DEGs)富集在825个GO terms中,显著性富集的terms15个;Ma24共1746个差异基因(DEGs)富集在858个GO terms中,显著性富集的terms5个;而Ma36共2584个差异基因(DEGs)富集在1076个GO terms中,显著性富集的terms22个。富集在昆虫免疫相关terms中的基因多呈现上调,在代谢有关terms中的基因多数下调。KEGG pathway分析结果显示:Ma12、Ma24和Ma36共有41个显著富集的pathway(Q-value≤0.05),3个时段均能显著富集的pathway有溶酶体、长时程抑制、内质网蛋白加工、谷胱甘肽代谢、其他多糖降解、戊糖和糖醛酸转换、吞噬体、抗原加工递呈等8个通路,富集在与免疫与疾病相关的通路中的差异基因表达多呈上调,而与代谢相关通路中富集到的差异基因表达多呈下调。通过GO、KEGG分析筛选到一些免疫相关基因,包括模式识别受体如肽聚糖识别蛋白(PGRP)、β-1,3-葡聚糖识别蛋白(βGRP)、C型凝集素(CTLs)、清道夫受体(SCRs)等、与信号调节有关的基因如丝氨酸蛋白酶及其抑制剂等、与信号转导有关的基因如Toll样受体蛋白、cactus、背相互作用蛋白、spaetzle蛋白等Toll途径中的关键蛋白,以及免疫效应因子基因如酚氧化酶原激活因子及Hdd11、防御素、天蚕抗菌肽、鞘翅素等抗菌肽,这些基因表达在MaZPTR-01菌株侵染后显著上调,表明酚氧化酶原级联反应和Toll途径控制的抗菌肽表达可能在幼虫早期免疫中发挥了重要作用。
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S763.306.4

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