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《南京林业大学》 2017年
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石榴安石榴苷代谢生化与分子基础研究

冯立娟  
【摘要】:我国石榴栽培历史悠久,种质资源丰富,富含生物活性物质,保健功能强,发展前景广阔。安石榴苷属于鞣花单宁,是石榴特有的酚类物质,含量高,抗氧化性强,对石榴保健功能起至关重要的作用。目前,安石榴苷在石榴果实中的代谢机理尚不清楚,极大地限制了石榴功能品质定向栽培调控和育种工作的开展。因此,本研究以中国主栽石榴品种为试材,建立了安石榴苷及其合成相关物质含量测定的高效液相色谱法HPLC优化体系,评价了不同品种发育期不同部位安石榴苷及其合成相关物质含量的变化规律及相关关系,克隆了安石榴苷代谢相关调控酶基因cDNA片段序列,进行了生物信息学和荧光定量PCR表达分析,比较分析了不同主产区石榴品种成熟期安石榴苷等酚类物质含量和抗氧化能力的差异,为揭示石榴果实功能物质安石榴苷形成的机理奠定了生化与分子基础。主要研究结果如下:(1)优化建立了HPLC测定‘泰山红’和‘泰山三白甜’石榴果皮、果汁、种子和叶片中安石榴苷及其合成相关物质含量的方法。安石榴苷、没食子酸和鞣花酸流动相为乙腈-2%冰乙酸水溶液=20:80,检测波长为270 nm。莽草酸和3-脱氢莽草酸流动相为甲醇-1%磷酸水溶液=5:95,检测波长为214 nm。五没食子酰葡萄糖流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液=20:80,检测波长为275 nm。6种物质的回收率均在98%以上,RSD在1.2%~2.2%之间。不同石榴品种果实不同部位安石榴苷及其合成相关物质含量存在显著差异。(2)不同石榴品种发育期不同部位安石榴苷及其合成相关物质呈现不同的变化趋势。莽草酸、3-脱氢莽草酸、安石榴苷、没食子酸、花青苷、总黄酮、总酚含量高低与叶片抗氧化能力密切相关。莽草酸、3-脱氢莽草酸与没食子酸代谢密切相关,没食子酸是五没食子酰葡萄糖合成的前体物质,鞣花酸是安石榴苷的降解产物。五没食子酰葡萄糖主要存在于叶片中。没食子酸和五没食子酰葡萄糖代谢成安石榴苷可能主要在果实部位。安石榴苷、没食子酸、鞣花酸、莽草酸、3-脱氢莽草酸、五没食子酰葡萄糖是石榴中的生物活性物质,其含量高低与其抗氧化能力密切相关。石榴果皮富含酚类物质,抗氧化能力最强,具开发利用潜能。(3)利用RT-PCR技术从石榴果皮中分离得到DHD/SDH和DAHPS基因3'端cDNA序列和DHQS基因的保守序列。DHD/SDH基因片段为1585 bp,含1265 bp的CDS序列,编码421个氨基酸,编码的蛋白具有DHQase I和SDH(AroE)两个保守结构域,GenBank登录号为KU133479。DAHPS基因cDNA片段为1373 bp,含有1180bp的CDS序列,编码393个氨基酸,编码蛋白具有Cys-Ser-Ala-His保守区和典型的DAHP_Synthe_2超家族保守结构域,GenBank登录号为KU198932。DHQS基因中间片段273bp,编码91个氨基酸,编码的蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守结构域,GenBank登录号为KY200850。对克隆的DHD/SDH和DAHPS基因编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构、信号肽、二级结构和三级结构等生物信息学指标进行了分析。(4)不同石榴品种安石榴苷代谢相关酶基因DAHPS和DHQS相对表达量随发育天数的增加逐渐降低,DHD/SDH逐渐升高。在整个果实发育期,‘泰山红’DAHPS、DHD/SDH和DHQS基因表达水平高于‘泰山三白甜’,两个品种果皮中DAHPS基因表达水平明显高于DHD/SDH和DHQS。相关性分析表明,DAHPS和DHQS与安石榴苷、没食子酸、鞣花酸和莽草酸显著正相关,与3-脱氢莽草酸和五没食子酰葡萄糖显著负相关,DHD/SDH与安石榴苷、没食子酸、鞣花酸和莽草酸极显著负相关,与3-脱氢莽草酸和五没食子酰葡萄糖极显著正相关。(5)各产区不同主栽石榴品种果实品质、酚类物质和抗氧化能力存在显著差异。果皮中安石榴苷、没食子酸、鞣花酸、花青苷、总黄酮、总酚含量和DPPH自由基清除率最高,果汁次之,种子最低。果实品质指标间、果实品质与酚类物质间存在一定的相关性,安石榴苷、没食子酸、鞣花酸、花青苷、总黄酮和总酚含量高低与其抗氧化能力密切相关。‘喀什甜’、‘千籽红’、‘泰山红’、‘红皮酸’和‘大马牙甜’等主栽品种综合品质佳,是值得大力推广和开发利用的优良品种。本研究系统分析了石榴中安石榴苷及其合成相关物质的组织、器官和发育特异性,克隆了安石榴苷代谢相关调控酶基因cDNA片段序列,进行了生物信息学和表达分析,评价了我国不同地区24个主栽品种成熟期果实品质,安石榴苷等酚类物质含量和抗氧化能力的差异及相关关系。研究结果为揭示石榴叶片和果实不同组织中安石榴苷代谢的库源关系、功能品质的栽培调控、深入挖掘果实营养价值与创制优异新种质奠定了理论基础,推进了对石榴功能物质安石榴苷代谢机理的研究。
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S665.4

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1 冯立娟;石榴安石榴苷代谢生化与分子基础研究[D];南京林业大学;2017年
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