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《南京林业大学》 2017年
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拟松材线虫致病性分化与致病相关基因研究

周立峰  
【摘要】:拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)是一种松树内寄生线虫,广泛分布于欧亚大陆的天然松林中。它与松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在形态学与生物学特性等方面都十分相似,是松材线虫的近缘种,它们拥有相同的食物资源与媒介昆虫,占据相同生态位。从拟松材线虫发现至今已有30余年,尚无研究表明其与松树大量死亡有关。近年来,越来越多的研究表明拟松材线虫部分虫株也具有较强的致病性。迄今为止,关于拟松材线虫的研究报道主要集中在其与松材线虫的区别、鉴定上,在其基因和蛋白水平上的研究鲜有报道。本研究通过转录组学和蛋白组学分析不同致病力拟松材线虫虫株在致病条件下差异表达基因的种类、数量和功能,并鉴定出了一些与致病相关的差异表达蛋白。为进一步研究拟松材线虫致病机制及致病相关基因的表达调控奠定基础。初步研究成果如下:1.拟松材线虫致病性研究为探讨拟松材线虫的致病性,将6株不同地理来源的拟松材线虫虫株接种到2年生的马尾松和湿地松上,接种后的松苗置于野外环境下观察,供水充足,温度自然。结果表明,这6株拟松材线虫虫株对两种松苗的致病力不同:马尾松苗的死亡率在22.2-83.3%之间,而湿地松苗的死亡率在0-33.3%之间。为进一步探讨拟松材线虫的致病性,在松苗致病力测定的基础上,挑选3株致病力显著差异的拟松材线虫接种到12年生黑松上,接种后的松树自然抚育。黑松死亡率在22.2-66.7%之间。实验期间,实验地的月均降雨量和月均气温与当地历史月降雨量、月气温相近,无极端天气情况出现。本实验证明了拟松材线虫具有致病性,高温、干旱等环境胁迫非其致病的必要条件。2.拟松材线虫群体遗传结构分析为探讨不同地理来源的拟松材线虫虫株的遗传背景,通过ISSR分子标记对来自国内14个省份及日本、韩国的61株拟松材线虫进行群体遗传结构分析。非加权组平均法聚类分析将拟松材线虫分为2个分枝,进一步通过主成分分析更清楚地将拟松材线虫分为4个以上组分。Mantel检测表明,拟松材线虫各虫株间的地理距离和遗传距离呈显著的弱相关性(p0.05,r=0.312)。拟松材线虫各虫株间的遗传分化系数为0.341,远大于遗传分化阈值0.25;另外,拟松材线虫各虫株间的基因流为1.091,接近生殖隔离指数1。这些说明,可能是长期的地理隔离,导致拟松材线虫各虫株间的生殖隔离,进而形成不同致病力的拟松材线虫虫株。3.拟松材线虫不同生境和不同发育阶段内参基因的筛选本研究应用geNorm、NormFinder、BestKeeper、deltaCq、RefFinder等5种分析方法评价了8个常见的内参基因在拟松材线虫不同发育阶段和生境条件下的表达稳定性。结果表明:在不同生境中,微管蛋白,18S核糖体RNA和泛素结合酶的表达较为稳定;而在不同发育阶段,微管蛋白,组蛋白和18S核糖体RNA表达较为稳定。4.拟松材线虫转录组与蛋白组分析应用RNA测序和蛋白质同位素标记相对和绝对定量技术采集了两个致力差异显著的拟松材线虫虫株的转录组和蛋白组数据,共获得了约40000个基因和5000个蛋白。拟松材线虫的转录组和蛋白组两个组学水平上的数据相关性较弱(r=0.138),表明转录后调控发生在致病过程中。功能分析发现5个致病相关蛋白在强致病力虫株中都是高表达的,其中过氧化物酶、脂肪酸与视黄醇结合蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶与应对寄主防御反应有关,纤维素酶、扩张蛋白与破坏寄主细胞壁有关。因此,拟松材线虫的致病机制可能与适应寄主体内生活有关。5.拟松材线虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因的克隆与功能验证基于拟松材线虫转录组测序数据,我们应用cDNA末端快速克隆技术克隆了拟松材线虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因的cDNA全长,分别是694和1630 bp。其中脂肪酸与视黄醇结合蛋白基因完整开放阅读框长度为537 bp,编码178个氨基酸,而钙网蛋白基因完整开放阅读框长度为1209 bp,编码402个氨基酸。为确认脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因与拟松材线虫致病的相关性,构建了这两个基因的RNA干扰体系。应用RT-qPCR检测经dsRNA和M9处理过的靶基因在转录水平上的表达量,其中以M9处理后的靶基因表达量为100%,GFP dsRNA处理后靶基因的表达量没有显著变化,而靶基因dsRNA处理后靶基因的表达量显著下降,其中FAR基因mRNA的表达水平只有对照的26.9%,CRT基因mRNA的表达水平也仅有对照的17.4%。不同处理的拟松材线虫幼虫在灰葡萄孢上培养10 d后,采用贝尔曼漏斗法收集线虫。M9处理后的幼虫平均每20对产生1239个F1代,而FAR dsRNA、CRT dsRNA和外源对照基因GFP dsRNA处理后的幼虫平均每20对产生945、906和1133个F1代。同时将RNAi处理后的线虫接种到2年生的黑松上,评估RNAi对拟松材线虫致病力的影响。接种五周后,M9、GFP dsRNA、FAR dsRNA三个处理出现死亡松苗,CRT dsRNA处理组第六周出现死亡松苗。靶基因dsRNA处理组死亡率(33.3-41.7%)显著低于M9(83.3%)和外源基因(75%)对照组,说明脂肪酸与视黄醇结合蛋白在拟松材线虫致病过程中起着重要作用。
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S763.18

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