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新疆杨转抗虫基因研究

王婕琛  
【摘要】: 杨树是重要的速生用材树种之一,采用基因工程技术开展转基因杨树的研究,是培育抗逆、抗虫和抗病杨树新品种的有效途径。 本研究以新疆杨(Populus alba var.pyramidalis)为材料,开展了新疆杨组织培养植株再生及基因转化组培受体系统影响因素的研究。探讨了基本培养基、生长素、细胞分裂素、叶盘接种方式、抗生素等因素对新疆杨叶盘再生不定芽的影响。结果表明:生长素的种类与浓度对叶盘分化频率影响不显著;不同种类的细胞分裂素影响叶盘分化频率,其中极低浓度的TDZ可显著提高叶盘分化频率。并探讨了抗生素Cef及Km对叶盘分化的影响,研究显示:加入Km的时间显著影响叶盘对Km的本底抗性。建立了高效的新疆杨基因转化组培受体系统:1/2MS+TDZ 0.005mg/L+BA 0.25mg/L+IAA 0.5mg/L为最佳叶盘分化培养基,分化频率可达100%,平均分化芽数可达6.18;附加Km15mg/L+Cef50mg/L进行叶盘Km~r芽的筛选,叶柄附加Km25mg/L+Cef50mg/L进行筛选。 在建立的新疆杨转化组培受体系统基础上,研究了影响根癌农杆菌LBA4404介导的杨树遗传转化的7个因素:预培养时间、侵染时间、共培养时间、添加乙酰丁香酮(AS)的时机、共培养培养基中添加AS浓度、侵染菌液的制备方法、外植体状态。最终建立了高效的新疆杨遗传转化系统:预培养8小时,OD600=0.4左右农杆菌菌液侵染15分钟,共培养5天;侵染菌液的最优制备方法是液体培养活化农杆菌两次加离心收集菌体重悬;共培养培养基中添加AS80umol/L。在此转化体系下,新疆杨叶盘转化频率由6%增加到38.10%,提高了5倍。 利用此转化系统,采用双基因共转化法,未得到预期的转Bt基因植株和转双基因植株,仅获得了转CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂)基因新疆杨植株。共获得96株Km~r植株,对其中的80株新疆杨Km~r植株进行了PCR检测,筛选得CpTI基因PCR阳性植株38株,占47.5%;在38个PCR阳性株系中选择了17个株系进行了斑点杂交检测,阳性株系有6个,占35.3%。在38个PCR阳性株系中选择了10个株系进行了饲虫实验,筛选到X46、X50两个株系对杨尺蠖幼虫的生长发育有较强的抑制作用,有进一步测试及推广的价值。部分转基因植株已移栽至苗圃,正在进行进一步检测分析。 采用菌种竞争性实验等三种方法,研究了未得到转Bt基因新疆杨植株的原因,初步推测可能是含有Bt基因或CpTI基因的两个菌株活力有明显差异。


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