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《南京林业大学》 2004年
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光肩星天牛分子遗传多样性及PCR鉴定技术的研究

安榆林  
【摘要】:光肩星天牛Anoplophora glaoripennis(Motschulsky)(鞘翅目Coleoptera/天牛科Cerambycidae),英文名Asian longhorned beetle(简称ALB)。光肩星天牛是我国森林的主要害虫,主要危害杨树、柳树及槭树等阔叶树,在我国华北、西北及东北(简称“三北”)地区危害十分严重,成为北方发展杨树及改善生态环境的一大障碍。据测算,我国每年因光肩星天牛等杨树天牛的危害造成的损失达20亿元。 1996年以来,美国相继在纽约、芝加哥和新泽西发现光肩星天牛危害,该天牛的发现引起了美国政府的高度重视。据美方统计,该种天牛一旦在美国传播开来,对美国7000万公顷的城市绿化林、槭糖工业及旅游业将产生直接威胁,直接经济损失将达到1380亿美元。由于美国认为该虫是从中国传入的,并于1998年9月11日签署了针对中国输华货物木质包装的一项临时法令。据统计,该项法令直接影响到我国对美出口商品的1/3至1/2,给我国对外贸易带来了巨大损失。此后,加拿大、欧盟、巴西等国家和组织纷纷对我国出口货物木质包装采取了严格的检疫措施,给我国对外贸易产生了严重影响。由此看来,光肩星天牛不仅给我国森林、生态环境及人民生活带严重危害,也对我国的对外贸易产生了很大的影响。 本研究应用随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)以及线粒体DNA(mtDNA)测序技术同时研究光肩星天牛分子遗传多样性,以便相互验证,并依据测序结果研制光肩星天牛PCR鉴定试剂盒。应用随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)共研究星天牛属的5个种样品:光肩星天牛、黄斑星天牛、星天牛、四川星天牛、楝星天牛,其中有20个不同地理种群的光肩星天牛(中国16个、美国3个、韩国1个)。为了验证实验结果的稳定性及代表性,我们分别与2001年、2003年、2004年开展了三次RAPD实验,从实验用随机引物数量到光肩星天牛地理种群数量均做了较大的调整,为总结明了,我们将这三次实验作为三组分别进行了分析。应用线粒体DNA(mtDNA)测序技术共测序了7个天牛基因序列,即COⅠ-1、COⅠ-2、COⅡ、COⅢ、ND4、16S RNA、Cytb基因,样品涉及星天牛属5个常见种及2个外缘种,以及中国的光肩星天牛种群达12个,黄斑星天牛种群4个,美国纽约、芝加哥光肩星天牛种群各1个;韩国光肩星天牛种群样品2个;7个基因中细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)进化速率最快,最适于遗传关系研究,其余则较保守;本研究对光肩星天牛各地理种群COⅠ基因进行了详细研究。主要结果如下: 1、首次建立了光肩星天牛随机扩增多态性DNA技术(RAPD)及线粒体DNA(mtDNA)基因测序实验方法,并用上述两种方法相互印证,明确了光肩星天牛地理种群间的遗传变异关系。 2、通过对光肩星天牛及其近缘种mtDNA的7个基因片断的测序研究,分析了光肩星天牛mtDNA的特点,并在GenBank上登录了光肩星天牛及其近缘种的9个基因序列,从而为天牛科,乃至鞘翅目昆虫mtDNA的研究奠定了基础。 3、建立了光肩星天牛DNA测序鉴定方法,研制了光肩星天牛PCR诊断试剂盒。并已获得了发明专利登记(登记号:200410014356.7)。本研究,共测序星天牛属5个常见 种及2个外缘种.其中采集中国的光肩星天牛种群达12个,黄斑星天牛种群4个,美国 纽约、芝加哥光肩星天牛种群各1个;韩国光肩星天牛种群样品2个.样品来源广泛, 几乎及盖了所有光肩星天牛分布区.从上述样品mtDNA COI基因序列特点来看,光肩星 天牛在该片断具有特异性,可用来鉴定光肩星天牛.上述光肩星天牛种群或个体的 mtDNA Col基因序列数据,建立了光肩星天牛分子生物学鉴定系统.在检疫中截获的任 何虫态的星天牛可采用本研究提供的引物序列及实验方法进行测序并采用相应的分析软 件比较基因序列,即可进行快速准确地鉴定光肩星天牛,而且还可通过所测基因序列的 变异判断光肩星天牛的来源。整个实验过程简单、经济且易于操作. 根据本研究测得的不同地理来源的光肩星天牛种群及其近缘种的线粒体DNA Col基 因504如序列中光肩星天牛特有的一段保守序列,设计了光肩星天牛的特异PCR引物Gl 和GZ,研制了光肩星天牛鉴定试剂盒.通过对加个光肩星天牛种群及包括6个星天牛属 种类在内的8个近缘种共38个种和种群进行了实验,结果表明该试剂盒准确、灵敏、操 作简便、实用性强。 4、根据相关实验结果,将光肩星天牛分为美国、韩国、中国南方和北方四个地理种 群.RAPD研究表明中国各地的光肩星天牛表现出了一定的差异,甘肃、内蒙、宁夏、 陕西、河北等地光肩星天牛之间遗传距离很小,常常聚于同一分枝中,而浙江、安徽、 湖北、江西、山东等地光肩星天牛有着相近的遗传关系;mtDNA Col基因测序结果也表 明分布于中国的光肩星天牛(含黄斑星天牛)的序列明显分为两个群体,一个属北方群 体,包括:甘肃、内蒙古、河北、陕西;一个属于南方群体,包括:安徽、江苏、浙江、 湖北、河南、山东、宁夏.序列结果还表明美国、韩国与中国的光肩星天牛存在明显标 志性差异.根据上述结果,可以将分布在全世界的光肩星天牛分为四个种群:即中国南 方、中国北方、韩国及美国光肩星天牛种群,中国南方与北方种群分界是秦岭还是黄河? 有待进一步研究. 5、应用RApD及m0NA测序
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S763

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