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《南京林业大学》 2005年 博士论文
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几种名贵洋兰转基因受体系统的建立及遗传转化

李杰  
【摘要】:研究了蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰转基因受体系统的建立和抗病基因转化,结果表明: (1) 由蝴蝶兰种子播种可获得大量无菌材料,在Hyponex培养基上,蔗糖浓度为25g/L时,种子萌发情况最好;也可从花梗节芽诱导营养芽从而建立快繁无菌体系,营养芽增殖的最佳激素组合为6-BA7.5mg/L+NAA1.0mg/L;在6-BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L的激素组合下,从无菌苗的叶片诱导类原球体的诱导率最高可达87.0%,1/2MS和Hyponex基本培养基对类原球体的增殖和分化效果较好;蔗糖浓度对类原球茎分化成苗的影响可用二次曲线拟合,在浓度为20g/L时,分化率达最高。 (2) 基因型对大花蕙兰丛生芽增殖有显著影响,差异的显著性在不同基因型间达不同水平,离散性和集中性具有分组特性;影响大花蕙兰丛生芽增殖系数差异的主要因子是细胞分裂素的浓度水平,二者关系可用二次式模型拟合;激素对愈伤组织的诱导和体胚发生的影响达极显著差异,2,4-D浓度升高,愈伤组织诱导率增加,但高于2.0mg/L时,外植体褐化死亡,KT是体胚发生的关键因子,其作用受到2,4-D的抑制和低浓度NAA的促进;石蜡切片观察表明,大花蕙兰体胚发生经过球形胚、鱼雷胚,最后发育成子叶胚,形成具有完整植株特性的原球茎。 (3) 以文心兰花梗为材料,在6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L的1/2MS培养基上,花梗营养芽的诱导率可达60%;花梗营养芽的茎段,在6-BA0.2mg/L+NAA1.0mg/L的培养基上,愈伤组织诱导率最高可达78%,诱导率受[NAA]/[6-BA]浓度比和光照强度的影响;在6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L的激素组合下,从愈伤组织分化出幼苗的形成率和商品化率可达到最佳效果,中、低无机盐浓度且全量的基本培养基较利于幼苗分化;当分化形成的幼苗株高为1~2cm时,可进一步状苗生根,生根苗在适宜条件下移栽,成活率可达99%以上。 (4) 以蝴蝶兰叶片为外植体进行农杆菌介导,最优化的转化条件为预培养时间4~5d,菌液浸染浓度OD_(600)=0.05,菌液浸染时间10分钟,pH值=5.4。浸染后,宜采用农杆菌渐次脱菌法,即在无任何抗生素的培养基上与农杆菌共培养5天后,在添加20mg/L的Cef培养基上继续共培养3个星期后,用加入了500mg/L Cef的诱导培养基,对外植体进行洗涤,再转入添加Cef50mg/L+Km10mg/L筛选培养基中继代培养,20d继代一次,优化条件下,Km~r抗性原球茎的分化率最高达到了16.2%,比基本转化条件下的最高分化率3.5%提高近5倍;在已获得的280株抗性芽中,随机抽取16株植株进行PCR检测,初步证明外源GAFP-NP1基因已整合到Km~r抗性植株的基因组中。 (5) 将适宜蝴蝶兰叶片遗传转化的条件直接运用于大花蕙兰和文心兰,仅能得到较低的转化率,除去各种原因损失的抗性芽外,目前有8株大花蕙兰和4株文心兰抗性芽表现出正常生长;为实现转化体的早期准确筛选,成功构建了pBin35S-GFP表达载体,可运用于大花蕙兰和文心兰乃至其它兰花遗传转化的研究中。


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