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《南京林业大学》 2008年
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大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究

吴开云  
【摘要】: 以培育广谱抗病大花蕙兰为目标,将外源双价抗病基因GAFP和NP-1以农杆菌介导法导入大花蕙兰基因组。对包括大花蕙兰诱导类原球茎(PLB)再生、农杆菌介导大花蕙兰抗病基因转化、大花蕙兰转基因植株分子检测、大花蕙兰转基因植株抗病性检测等几个相关方面进行了比较系统的研究。 一、分别以大花蕙兰试管苗叶片和基部切块作为外植体,成功诱导出PLB,实现大花蕙兰组培再生技术。基于MS培养基,大花蕙兰幼苗叶片诱导PLB是可以实现的,但叶片部位对PLB诱导有最重要的影响,叶片基部可以诱导PLB,而中段和叶尖基本不会诱导出PLB。利用大花蕙兰试管苗基部切块获得更高的PLB诱导率和繁殖系数。 二、实验结果表明,未经转化的大花蕙兰PLB对卡那霉素(Km)的敏感性很高。当Km浓度达到7.5 mg/L时,CAH和PET的PLB继代诱导率为0%。当Km浓度达到12.5 mg/L时,CMM和CWI的PLB继代诱导率为0%。筛选培养基的Km最佳浓度(选择压)为12.5mg/L。不同抗生素对农杆菌的抑制效果有显著差异,在5个种类的抗生素中,以头孢霉素(Cef)抑菌效果最佳,并且对大花蕙兰PLB的继代增殖诱导影响不明显,筛选培养基最佳Cef浓度设为50mg/L。 三、本研究独创性地采取参数池研究策略,利用携带pBin35S- GAFP-NP1基因质粒的LBA4404工程菌株,分两步正交实验完成了对农杆菌介导基因转化的影响因子的研究。通过第一步实验,确定在预培养基添加AS显著提高基因转化的效率,最佳AS浓度为100μmol/L,当OD600值在0.2Abs时大花蕙兰转化阳性率最高。侵染液和共培养基pH值为5.2时,转化子阳性率最高。第二步实验确定最佳侵染时间为20min,最佳的预培养时间为4d,较长的共培养时间如6d和9d的转化率显著提高。独创的“二次筛选转化子继代诱导PLB抗Km一致性筛选策略”,在筛选抗Km阳性转化子的实验中得到成功运用。 四、本研究用改进的SDS裂解法的提取大花蕙兰DNA样品,限制性内切酶酶切效果和引物PCR扩增效果均比较理想。用SDS和异硫氰酸胍两种不同的蛋白变性剂,分别进行了RNA提取实验,其中SDS法提取的RNA的产量较高。本研究显示抗Km阳性的转化子均可以通过特异引物PCR反应检测到目的基因条带。Southern blot结果表明目的基因已整合到大花蕙兰基因组DNA中,而且既有单拷贝也有多2个以上拷贝的转化子。RT-PCR实验结果在基因表达水平上进一步确定外源基因已整合到大花蕙兰基因组中,并能在大花蕙兰组织中表达。 五、从大花蕙兰炭疽病病叶分离得到病原菌,经接种实验表明具有使大花蕙兰发生炭疽病的能力,鉴定为胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Sacc.)。通过叶片蛋白提取液的琼脂糖孔穴扩散抑菌实验和炭疽病接种离体叶片的抗病试验,证明获得的转基因大花蕙兰具有对炭疽病的抗性。
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