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《南京林业大学》 2010年
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杉木分枝发育关键基因的克隆与功能鉴定

李霞  
【摘要】: 植物分枝发育在植物形态建成中具有十分重要的地位。植物形态发育模式多样性的主要来源是腋生分生组织行为的不同。了解植物分枝机理不仅具有理论意义,对于农业、林业、果树、蔬菜和花卉等生产实践更具有重要意义。作物的分枝是影响作物结实多少并进而影响单产的重要农艺性状之一,是禾本植物如水稻,小麦,大麦产量的主要原因。 本研究巧妙的使用杉木不分枝突变体的材料-独杆杉,通过优化的杉木cDNA-AFLP差异显示技术分离了杉木分枝相关的关键基因,构建了分枝的调控网络。由于目前对于分枝的研究主要是建立在分枝形态变异突变体的研究,只得到了一系列的分枝调控基因,这个分枝遗传调控网络的建立对于系统的了解分枝的分子机理有重要的参考价值。通过RACE技术克隆了其中四个基因的全长,实时荧光定量RT-PCR(FQ RT-PCR)技术分析了其组织表达差异,并构建过量表达载体通过脓杆菌转化拟南芥进行了功能验证,为顶端优势和了解杉木的分枝机理提供一定的理论参考。主要的研究结果包括: 1.杉木“020”的物候期 为了更好的了解研究材料的发育规律,初步分析了“020”生长物候期及形成层的周期性活动。 4月底5月初,第一层分枝的腋芽形成。5月底至六月初,形成了二层分枝的腋芽。7月底,是形成第三层侧枝腋芽的活跃期。杉木“020”新梢有两次明显的快速生长期:5月为第一次快速生长期,6月中旬到7月初为第二次快速生长期。杉木“020”形成层活动早,休眠晚,活动周期较长:2月中旬开始恢复活动,有4~5层的扁平的形成层细胞;从4月中旬至6月底,是形成层的活动旺盛期,细胞层数达到7-8层;11月上旬进入休眠期,形成层4~5层。这在一定程度上可以解释这个无性系速生型的特点。 2.杉木cDNA-AFLP体系的优化 为了保证差异显示结果的其稳定性与高效性,建立并优化了适用于杉木的cDNA-AFLP体系。扩增体系优化后的PCR产物经6%PAGE电泳得到清晰、稳定、分辨率较高的多态性条带。 3.杉木分枝发育关键基因的克隆与分析 本研究以杉木“020”分枝顶芽和不分枝顶芽、突变体-独杆杉顶芽为材料,通过cDNA-AFLP技术筛选到与杉木分枝相关的关键的基因。其中,正调控分枝的基因43条,负调控分枝的基因22条。 对差异表达基因的系统分析表明,未分枝材料表达的分枝负调控基因和分枝材料表达的分枝正调控基因在所调控的生理过程上有很大差别。分枝负调控基因主要涉及:生长素合成,激素信号传导、电子传递,叶绿素合成等。而分枝正调控基因主要涉及:细胞分裂控制,糖基和糖苷转移,糖转运,转录水平调控和翻译水平调控等。据此,我们构建了杉木的分枝调控网络,对研究分枝的遗传调控机制提供重要参考。 4.基因全长的克隆与功能验证 本研究通过RACE克隆了分枝调控基因:杉木PAE、RAB11C、RNaseⅢ和DELLA的cDNA全长序列,定量PCR研究了它们的表达模式,并构建正义过量表达载体进行功能验证,探讨了这四个基因调控分枝的机理。 (1)杉木PAE基因通过激素信号传导调控杉木的分枝ClPAE基因cDNA序列长度为1031bp,开放性阅读框(ORF) 711bp,编码237个氨基酸。通过对其编码蛋白CDD的研究发现,该基因编码的是20S蛋白酶体α亚基5。氨基酸多重比对发现该基因氨基酸序列在物种间相对保守。实时荧光定量RT-PCR结果显示:ClPAE基因的表达有较大的组织差异,在花序、叶中的表达最强,而在初生茎段和次生茎段中表达最弱。过量表达拟南芥植株出现了分枝增加现象,顶端分生组织被平分成两半,形成了类似二叉分枝。推测原因是:该基因的表达有一个表达量的精确调控。抑制PAE基因的表达能够促进分枝,但是过量表达可能引起调控网络的变化又能促进分枝。 (2)杉木Rab 11 C通过激素的运输调控杉木的分枝杉木RAB11C cDNA全长序列长度为1133bp,有639bp的开放性阅读(ORF),编码213个氨基酸。其与美洲黑杨RAB11C的一致性高达82.57%。CDD分析发现该蛋白质是Ras-like GTPase超家族的成员-RAB11C蛋白,具有RAB蛋白保守的结构域。在同源树上与美洲黑杨及拟南芥的RAB11C归为一大支。实时荧光定量RT-PCR分析表明,ClRAB11C基因组织表达差异不大,可能广泛参与各种生理过程。过量表达RAB11C基因的拟南芥植株表现为:生长缓慢,植株颜色呈紫色,在长出4-6片真叶时死亡的发育过程。推测其通过作用于胞内的囊泡运输调节激素载体的定位来影响植物的形态发育,包括对分枝的遗传调控。 (3)杉木RNaseⅢ基因在转录水平或翻译水平调控杉木的分枝杉木ClRNaseⅢcDNA全长序列,该序列长度为1045bp,包括705bp的开放性阅读(ORF),编码235个氨基酸。氨基酸序列多重比对发现其氨基酸序列物种间差异较大。该基因编码大肠杆菌类的RNaseⅢ,有5个活性位点,3个金属离子结合位点,13个聚合互作位点。实时荧光定量RT-PCR分析表明,RNaseⅢ基因组织表达差异较大,可能与其功能的特异性有关。可能该基因只是杉木分枝调控网络中的组成成份,而不是“分子开关”。过量表达该基因的拟南芥植株长势较慢,颜色暗绿,没有形成分枝变异表型。 (4)杉木DELLA负调控GA效应促进杉木分枝杉木DELLA cDNA全长序列,该序列长度为2656bp,包括5’端非编码区178bp,3’端非编码区365bp,Poly(A)尾28bp和2085bp的开放性阅读(ORF),编码695个氨基酸。DELLA的N端同源性总体上不高,所以氨基酸序列进行多重比对发现其与美洲黑杨的一致性仅为47.08%。CDD分析发现该蛋白质是有DELLA家族蛋白保守结构域:DELLA结构域、VHYNP结构域、LERLL结构域、核定位信号结构域和SAW结构域。同源树上杉木作为裸子植物单独归为一类。我们推测其通过负调控GA信号的传导,抑制杉木的伸长生长从而促进杉木的分枝。
【学位授予单位】:南京林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S791.27

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