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《江苏大学》 2016年
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胶体金适配子试纸条现场快速筛查中药中赭曲霉毒素A研究

周伟璐  
【摘要】:赭曲霉毒素A(Ochratoxin,OTA)是一类主要由曲霉菌和青霉菌的某些菌株所产生的赭曲霉毒素中分布最广泛、毒性最强、对人类威胁最大的毒素。多种食品、农产品、中药材都容易被OTA污染,给消费者造成严重的健康安全隐患。为此,很多国家对食品及农产品中OTA的最大残留量水平进行了规定,但尚缺乏中药材中OTA的限量标准。中药材在生长、采收、加工、储存、运输过程中均易霉变而产生OTA;并且目前针对OTA的检测方法大多需要专门的仪器设备、专业技术人员和复杂操作过程,无法满足现场快速检测的要求。因此亟需建立简单、灵敏、准确的分析方法用于中药材中OTA的快速检测。胶体金免疫试纸条以其操作简单、可现场筛选等优势非常适合大批量中药材中OTA的现场快速检测。但基于抗体的免疫试纸条具有抗体合成困难、稳定性差、假阳性率高等缺点。适配子作为一种可体外化学合成、结构稳定、具有高亲和性和特异性的“化学抗体”,完善了免疫试纸条检测出现的不足。为此,本论文建立并完善了基于适配子的胶体金试纸条,并用于中药(黄芪、茯苓和天麻)中OTA的现场快速筛查,同时采用液质联用技术进行确证,以保证检测结果的准确性和可靠性。主要研究内容和结论如下:(1)胶体金及金标适配子偶联物的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,并就主要影响因素进行优化,确定最佳制备条件为:柠檬酸三钠添加量:2.5 mL,反应沸腾时间:8 min,搅拌速率:100 rpm,先氯金酸后柠檬酸三钠的添加顺序,最终制备出粒径10 nm左右的胶体金颗粒。在胶体金与适配子的偶联过程中,通过对最佳标记量和最适pH值的考察,确定适配子稳定胶体金的最适量为1mL胶体金:6μL 10μM适配子,同时以10μL 0.1mol/L K2CO3溶液用于调节胶体金标记适配子时最适pH值。采用紫外分光光度法、透射电镜法和Mey氏稳定化法对制备得到的金标适配子偶联物进行表征,结果确证适配子与胶体金偶联成功。(2)胶体金适配子试纸条的自组装对金标适配子偶联物复溶液配方及偶联物稀释倍数、检测线probe1和质控线probe2工作液及浓度范围、结合垫及样品垫预处理液、硝酸纤维素膜的型号、检测液配方及检测液中甲醇最大耐受量等关键因素进行考察,获得针对OTA的胶体金适配子试纸条的最佳制备条件。根据最佳制备条件自组装胶体金适配子试纸条用于OTA标准品溶液的检测,结果显示该适配子试纸条对OTA的灵敏度为1 ng/mL,且具有良好的特异性和稳定性。(3)胶体金适配子试纸条快速筛查中药样品中OTA的污染情况及液质确证样品经80%甲醇-水溶液提取和4倍稀释后可用于试纸条检测。对黄芪、茯苓和天麻阴性样品进行基质加标后采用胶体金适配子试纸条检测。结果显示,茯苓和天麻样品的基质效应基本消除,其基质检出限为1 ng/mL,而黄芪基质效应未能完全消除,其基质检出限可达到2.5 ng/mL。进而,采用自组装的试纸条检测9批黄芪、6批茯苓和8批天麻样品中OTA的含量。其余样品均为阴性,只有黄芪甘肃批次样品呈OTA阳性,并经超高效液相色谱联用质谱技术(UFLC-MS/MS)确证,该黄芪甘肃样品中OTA含量为3.98μg/kg。结果表明本自组装胶体金适配子试纸条可用于黄芪、茯苓和天麻样品中OTA的快速检测,并可拓展用于更多中药样品中其它真菌毒素的现场检测。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R284.1

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