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《江苏大学》 2017年
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PKGⅡ对胃癌细胞EGF/EGFR介导的蛋白质表达和蛋白质磷酸化的调控作用

钱海  
【摘要】:Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(Type Ⅱ cGMP dependent protein kinase,PKG Ⅱ)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,能够通过使蛋白质发生磷酸化对相关的细胞活动发挥调控作用。我们的前期研究发现,PKG Ⅱ能够通过使EGFR发生磷酸化,抑制EGFR自身以及其下游信号转导通路的激活,进而影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学活动,是一种潜在的新型EGFR抑制剂。EGFR是与多种肿瘤的发生发展相关的受体酪氨酸激酶,它的过表达、激活或突变能够促进肿瘤细胞的增殖和转移。包括EGF在内的配体与EGFR结合,可使其酪氨酸激酶活性增加,导致下游信号转导通路的过度活化,使得细胞的多种生物学活动发生改变。而在这些改变中,不可避免地要涉及蛋白质表达和蛋白质磷酸化的改变。我们的前期工作已经对PKG Ⅱ抑制EGF/EGFR介导的信号转导和生物学活动变化进行了系统的研究和阐述。为进一步了解PKG Ⅱ对EGFR的抑制作用,本研究采用蛋白印迹法和双向电泳结合质谱分析等方法,观察了PKG Ⅱ对EGFR激活导致的蛋白表达改变和蛋白磷酸化水平改变的抑制/逆转作用。在蛋白质表达方面,我们首先研究了PKG Ⅱ对已知的EGFR介导的蛋白质表达是否具有调控作用。通过文献检索,发现EGF作用能够改变161种蛋白的表达水平,其中102种蛋白的表达升高,49种蛋白的表达下降。我们选取了MMP1(与细胞迁移相关)、c-MYC(与细胞增殖相关)和NOS1三种蛋白作为观察对象,用Western blotting进行了检测,结果表明,在胃癌细胞株AGS和HGC-27中,PKG Ⅱ能够有效地抑制EGF诱导的MMP1、c-MYC和NOS1蛋白表达水平升高,表明PKG Ⅱ对已知的受EGFR调控的蛋白表达具有抑制效应。为进一步深入了解EGF/EGFR对胃癌细胞蛋白表达的调控作用以及PKG Ⅱ对其作用的抑制效应,我们通过双向电泳和质谱分析,在AGS细胞株中鉴定了17种未见报道、其表达受EGF/EGFR调控的蛋白质,并检测了PKG Ⅱ对EGF/EGFR调控作用的抑制效应。其中15种蛋白(peroxiredoxin 3(Prdx3)、ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1(UBE2V1)、taf6 RNA polymerase Ⅱ、nuclear autoantigen、Enoyl-Coenzyme A(Coa)、nitrilase homolog 1、thioredoxin-related transmembrane protein 2、erbB3 binding protein EBP1、mitochondrial dihydrolipoamide succinyltransferase、Glutamate Dehydrogenase、solute carrier family 1、chaperonin containingtcp1、farupstreamelement-bindingprotein1(fubp1)、unnamedproteinproduct、fas(tnfrsf6)bindingfactor1)的表达水平在egf作用时升高,pkgii可有效地抑制egf引起的表达增加;2种蛋白(marveld3和annexiniii)的表达水平在egf作用时下降,而pkgii能逆转egf的作用,使其表达增加。为进一步验证egf和pkgii作用,研究通过westernblotting,在ags和hgc-27细胞中进一步检测了这17种蛋白中的四种(prdx3、ube2v1、marveld3和fubp1)在egf作用时表达的变化以及pkgii对其的抑制作用,结果显示egf作用使prdx3、ube2v1和fubp1表达增加,使marveld3表达减少;pkgii可有效地逆转egf的刺激和/或抑制作用。研究还通过rna干扰等技术,对marveld3的功能进行了检测,发现pkgii通过逆转egf诱导的marveld3蛋白表达水平下调,使得marveld3含量增加,有效地抑制egf作用所导致的肿瘤细胞emt和迁移能力的增强。在蛋白质磷酸化方面,我们用磷酸化蛋白富集试剂盒分离/富集ags细胞中的磷酸化蛋白,再通过双向电泳和质谱分析,检测、鉴定出了5种其磷酸化水平在egf作用时发生明显改变的蛋白(hirip3、hbo1、basonuclin2、lsfr1和pea15),其中3种蛋白(hirip3、hbo1和basonuclin2)的磷酸化水平在egf作用时升高,2种蛋白(lsfr1和pea15)的磷酸化水平在egf作用时下降;pkgii对egf作用导致的这些蛋白磷酸化水平变化均有抑制作用。研究进一步通过ip-westernblotting联用的方法检测了胃癌细胞株ags和hgc-27中hirip3和hbo1的酪氨酸磷酸化水平在egf和/或pkgii作用时的改变,结果显示egf作用能够使hirip3和hbo1的酪氨酸磷酸化水平升高,pkgii能够抑制这一变化,验证了pkgii对egf作用所致的蛋白质磷酸化水平改变的抑制效应。研究还选用hirip3为观察对象,对pkgii抑制egf/egfr引起的相关蛋白质磷酸化改变的机制进行了初步探讨。首先用核浆分离法检测了egfr在细胞内的定位,结果显示在胃癌细胞株ags和hgc-27中pkgii均能够抑制egf诱导的egfr核转位;然后采用免疫共沉淀方法在两个细胞株中均检测到了核蛋白hirip3能够与egfr结合,提示egfr能够直接与hirip3结合并使其磷酸化,pkgii则是通过抑制egfr核转位而抑制egf/egfr引起的hirip3磷酸化。对于pkgii抑制egfr激活导致的蛋白质磷酸化水平改变的意义,本研究也进行了探讨:由于HBO1和Hirip3均能够调节组蛋白的修饰(甲基化、乙酰化),我们用Western blotting方法检测了这两个蛋白下游组蛋白修饰水平的改变。结果显示在胃癌细胞株AGS中PKG Ⅱ能够显著降低EGF刺激导致的Hirip3和HBO1下游蛋白H3K56ac、H3K27me3、H4K5ac等甲级化/乙酰化修饰蛋白水平的升高;在HGC-27细胞中,PKG Ⅱ能够显著降低EGF刺激导致的H3K56ac和H4K5ac乙酰化修饰蛋白水平的升高,表明EGF/EGFR介导的Hirip3和HBO1磷酸化能够调控组蛋白的修饰,而PKG Ⅱ对EGFR的这一效应具有抑制作用。综上所述,本研究结果显示PKG Ⅱ能够抑制EGF作用导致的多种蛋白表达的改变,对EGF作用导致的多种蛋白质磷酸化水平的变化也有逆转作用,在信号转导的最后部分---蛋白质表达和磷酸化水平证明了PKG Ⅱ对EGFR介导的细胞生物学活动改变的抑制作用,为确认PKG Ⅱ是一种新型的抑癌因子提供了更多的实验室依据。
【关键词】:Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶 表皮生长因子受体 蛋白质表达 蛋白质磷酸化
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R735.2
【目录】:
  • 摘要5-8
  • abstract8-11
  • 英文缩写索引11-15
  • 第一章 绪论15-28
  • 1.1 PKG Ⅱ的研究背景15-18
  • 1.1.1 PKG的种类与分布15
  • 1.1.2 PKG Ⅱ的结构15-16
  • 1.1.3 PKG Ⅱ的主要功能16-17
  • 1.1.4 PKG Ⅱ与肿瘤的联系17
  • 1.1.5 PKG Ⅱ活性的调节机制17-18
  • 1.2 EGFR的研究背景18-26
  • 1.2.1 EGFR的结构和功能18-19
  • 1.2.2 EGFR与肿瘤19
  • 1.2.3 以EGFR为靶点的抗肿瘤药物19-20
  • 1.2.4 EGFR激活的细胞膜受体信号转导通路20-21
  • 1.2.5 EGFR的核转位及其相应信号通路的激活21-26
  • 1.3 研究目的和研究意义26
  • 1.3.1 研究目的26
  • 1.3.2 研究意义26
  • 1.4 研究内容、方法和技术路线26-28
  • 1.4.1 研究内容26
  • 1.4.2 研究方法26-27
  • 1.4.3 技术路线27-28
  • 第二章 PKGⅡ对EGF诱导的蛋白表达水平的影响28-65
  • 2.1 材料28-32
  • 2.1.1 细胞株、腺病毒以及质粒28
  • 2.1.2 主要试剂28-29
  • 2.1.3 主要溶液29-31
  • 2.1.4 主要仪器31-32
  • 2.2 方法32-40
  • 2.2.1 细胞培养32
  • 2.2.2 腺病毒质粒的扩增、提取及病毒包装32-34
  • 2.2.3 腺病毒浓缩34-35
  • 2.2.4 细胞处理35
  • 2.2.5 总蛋白提取35
  • 2.2.6 Bradford蛋白浓度测定35
  • 2.2.7 等点聚焦电泳35-36
  • 2.2.8 胶条平衡36
  • 2.2.9 第二向垂直电泳36
  • 2.2.10 固定、银染显色,图像分析36-37
  • 2.2.11 质谱分析37-38
  • 2.2.12 Western blotting38
  • 2.2.13 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)38-39
  • 2.2.14 细胞转染39
  • 2.2.15 Transwell迁移实验39-40
  • 2.2.16 统计学分析40
  • 2.3 结果40-61
  • 2.3.1 文献检索结果40-41
  • 2.3.2 文献检索结果的验证41-42
  • 2.3.3 双向电泳分离蛋白及图像分析42-44
  • 2.3.4 MALDI-TOF串联飞行质谱鉴定蛋白44-54
  • 2.3.5 质谱分析结果验证54-57
  • 2.3.6 MarvelD3对EGF诱导的细胞EMT及迁移能力的影响57-60
  • 2.3.7 免疫共沉淀实验(Co-IP)检测FUBP1与EGFR的结合60-61
  • 2.4 讨论61-65
  • 第三章 PKGⅡ对EGF诱导的蛋白磷酸化水平的影响65-85
  • 3.1 材料65-67
  • 3.1.1 细胞株、腺病毒以及质粒65
  • 3.1.2 主要试剂65-66
  • 3.1.3 主要仪器66-67
  • 3.2 方法67-70
  • 3.2.1 细胞培养67
  • 3.2.2 细胞感染67
  • 3.2.3 细胞处理67
  • 3.2.4 磷酸化蛋白富集67-68
  • 3.2.5 细胞核、细胞浆分离68-69
  • 3.2.6 Bradford蛋白浓度测定69
  • 3.2.7 等点聚焦电泳69
  • 3.2.8 质谱分析69
  • 3.2.9 Western bloting分析69
  • 3.2.10 免疫共沉淀(Co-IP)实验69
  • 3.2.11 免疫沉淀-Western blotting联用69-70
  • 3.2.12 统计学分析70
  • 3.3 结果70-82
  • 3.3.1 磷酸化蛋白富集的效果70
  • 3.3.2 双向电泳结果70-72
  • 3.3.3 质谱分析结果72-76
  • 3.3.4 用IP-western bloting连用分析Hirip3的泛酪氨酸磷酸化水平76
  • 3.3.5 用IP-western bloting联用分析HBO1的泛酪氨酸磷酸化水平76-77
  • 3.3.6 免疫共沉淀实验检测Hirip3与EGFR的结合77
  • 3.3.7 核浆分离实验检测PKGⅡ抑制EGF刺激的EGFR核转位77-82
  • 3.4 讨论82-85
  • 第四章 结论与展望85-86
  • 4.1 主要结论85
  • 4.2 展望85-86
  • 参考文献86-102
  • 致谢102

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1 钱海;PKGⅡ对胃癌细胞EGF/EGFR介导的蛋白质表达和蛋白质磷酸化的调控作用[D];江苏大学;2017年
2 帅帅;TIP30核内化通过EGF/EGFR信号通路调控cyclin D1基因转录的分子机制研究[D];南方医科大学;2014年
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相关作者
>钱海 >帅帅
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