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《江苏大学》 2017年
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糖尿病心肌缺血/再灌注损伤机制研究:Sirt1的作用

陶艾彬  
【摘要】:背景及目的:心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤是指再灌注治疗缺血心肌本身所导致的心肌细胞进一步损伤。在糖尿病患者中,心肌的缺血/再灌注损伤明显较无糖尿病患者严重,且进一步恶化了临床转归。但直到目前为止,导致糖尿病心肌细胞缺血/再灌注损伤易感性增加的确切机制仍不明确。病理学研究显示,细胞凋亡是梗死周边区域内心肌细胞死亡的主要方式,尤其在心肌再灌注期间,而线粒体在这一过程中起着重要作用。线粒体需要通过持续的分裂和融合以保持其形态的动态平衡,并藉此维持其自身及所在细胞的正常功能,过度的线粒体分裂将促进细胞凋亡。线粒体的分裂受到动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)调控,而Drp1的活性又受控于自身丝氨酸(Serine,Ser)位点的磷酸化程度。但Drp1的过度激活是否为增加糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的潜在机制尚不明确。沉默信号调节因子2相关酶1(Silent information regulator factor 2 related enzyme 1,Sirt1)是III类组蛋白去乙酰基转移酶,其可通过去乙酰化作用于核转录因子以调控蛋白表达,亦通过翻译后修饰作用调节蛋白质功能。近年有研究显示,Sirt1在相关心血管疾病的病理过程中起保护作用。本研究将立足于此,研究糖尿病是否导致心肌细胞Sirt1表达及活性改变,并由此增加糖尿病心肌对缺血/再灌注损伤易感性,同时明确其内在的分子机制。研究方法:1.动物实验研究:6周龄雄性C57BL/6小鼠予以腹腔注射链佐星(50mg/kg/d,连续3天)制备糖尿病模型;采用结扎、释放左冠状动脉前降支的方法给予缺血/再灌注损伤;使用Sirt1激活剂腹腔注射以增加Sirt1活性。通过Western blot法检测心肌组织内Sirt1的表达,Sirt1活性荧光检测试剂盒测定心肌内Sirt1活性,透射电镜对比观察心肌线粒体形态变化,组织切片TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,Evans蓝和TTC染色测定心肌梗死面积,心脏超声评估心功能。2.细胞实验研究:原代培养新生小鼠心肌细胞,高糖(葡萄糖30m M)培养以模拟体内高血糖环境,给予缺氧/复氧处理以模拟体内缺血/再灌注损伤;予以Sirt1激活剂和Sirt1CRISPR激活质粒分别在药物水平及蛋白水平增加Sirt1活性;使用Wortmannin抑制蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)磷酸化。予以Akt si RNA抑制心肌细胞Akt蛋白表达。采用线粒体分离试剂盒分离线粒体和细胞浆;通过Western blot法检测相关蛋白表达水平;Sirt1活性荧光检测试剂盒测定心肌细胞Sirt1活性;检测心肌细胞caspase 3活性、DNA片段(Cell death ELISA)和TUNEL染色以评估心肌细胞凋亡;采用细胞活染及激光共聚焦扫描的方法,检测线粒体活性氧及线粒体形态学变化。结果:1.STZ成功诱导小鼠糖尿病8周后,小鼠心肌内Sirt1蛋白表达水平下降、活性降低,伴随着心肌缺血/再灌注损伤的加剧;糖尿病小鼠在心肌缺血/再灌注损伤后,其心肌细胞凋亡、心肌梗死面积及心功能恶化程度均较非糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注损伤加剧;Sirt1激活剂预处理糖尿病小鼠后,可减少缺血/再灌注所介导的心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死面积并改善心功能。2.高糖培养后的新生小鼠心肌细胞导致心肌细胞内Sirt1蛋白表达和活性均降低,并伴随着缺氧/复氧刺激后细胞凋亡加剧;药物或基因水平增加高糖培养下心肌细胞Sirt1活性,均可减轻缺氧/复氧所介导的过度细胞凋亡。3.高糖加剧了心肌细胞缺氧/复氧刺激后的线粒体分裂和氧化应激反应,其机制是加剧了Drp1 Ser637位点的去磷酸化,导致Drp1活性过度激活并促进其进一步向线粒体转移;Sirt1可通过干预上述分子机制缓解过度的线粒体分裂和氧化应激反应。4.心肌细胞内Sirt1下降的同时伴随着Akt活性下降,表现在Akt Ser473位点的磷酸化水平降低;Akt Ser473位点的磷酸化与Drp1 Ser637位点的磷酸化水平呈正相关(与Drp1活性呈负相关);在高糖和缺氧/复氧共同刺激下,Sirt1可通过增加Akt Ser473位点的磷酸化水平促进Akt活性,并由此增加Drp1 Ser637位点的磷酸化,降低Drp1活性并抑制其向线粒体迁移。结论:1.糖尿病导致心肌组织内Sirt1蛋白的表达下调和活性下降,并由此增加了糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的易感性。2.线粒体的过度分裂加剧了糖尿病心肌缺血/再灌注损伤。3.Sirt1表达的下调及活性降低,下调了心肌缺血/再灌注时Akt Ser473位点磷酸化水平,并由此导致Drp1 Ser637位点磷酸化进一步减少,促进线粒体过度分裂及细胞凋亡,加剧糖尿病心肌缺血/再灌注损伤。4.Sirt1/Akt/Drp1轴在糖尿病心肌缺血/再灌注损伤易感性增加的机制中起重要作用。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R587.2;R542.2

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