基于碳材料的生物传感器用于Fe~(2+)和葡萄糖检测的研究

【摘要】：食品营养与安全关系国计民生,检验检测技术对保障食品营养与安全,人类健康至关重要。传统检测方法主要存在仪器设备价格昂贵,成本高,耗时长,操作人员需要专门的培训,检测步骤繁琐等缺点,制约了其广泛使用。碳纳米材料具有比表面积大,生物兼容性好,易修饰,来源广泛等优点,在生物传感分析领域受到人们越来越多的关注。本文基于碳纳米管(CNT)与天然酶及模拟酶合成的复合材料,建立了比色法检测Fe~(2+)和葡萄糖。具体研究内容如下:(1)利用羧基化的CNT共价结合辣根过氧化物酶(HRP)制备CNT-HRP复合材料。Fe~(2+)与H_2O_2之间的芬顿反应消耗H_2O_2,随着反应溶液中Fe~(2+)浓度的增加,H_2O_2被消耗,减弱了TMB被氧化程度,基于此原理实现对Fe~(2+)的定量检测。最佳反应条件:合成CNT-HRP复合材料所用HRP浓度为50μg/mL,反应pH为6.3,Fe~(2+)与H_2O_2的反应时间为2 min,H_2O_2浓度为60μM。在最佳反应条件下,对Fe~(2+)的最低检测限为0.22μM,线性检测范围是0.8-100μM。本方法具有很好的选择性,常见金属离子对检测没有干扰,尤其可以对Fe~(2+)和Fe~(3+)进行区分。该生物传感器灵敏度高,特异性强,成本低,操作简单,有望应用于食品检测。(2)利用CNT表面的羧基和辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶(GOD)的氨基反应合成CNT-HRP-GOD三元复合材料,GOD催化氧化葡萄糖原位产生H_2O_2,HRP催化H_2O_2氧化TMB产生显色物质,实现葡萄糖的快速检测。复合材料增加了活性位点,使CNT表面固定的酶分子量增加,固定化酶加速了不同物质之间的电子传递,减少了产生的H_2O_2的扩散。利用CNT-HRP-GOD复合材料对葡萄糖进行检测,最低检测限为0.3μM,线性检测范围为1-100μM,在实际样品血清中的加标回收率为90.97%-110%。溶液中共存的葡萄糖类似物和金属离子对检测不产生干扰,本方法有望用于实际样品检测,并对其他生物传感器的制备提供指导。(3)通过一步溶剂热法制备了ZnFe_2O_4/CNT复合材料,CNT表面的羧基经过EDC的活化与GOD表面的氨基发生氨羧缩合反应,GOD通过酰胺共价键结合到ZnFe_2O_4/CNT复合材料表面,制备了ZnFe_2O_4/CNT-GOD三元复合体系,并用于检测葡萄糖。比表面积大的CNT可以负载大量过氧化物模拟酶ZnFe_2O_4,当反应体系中存在葡萄糖时,GOD催化氧化葡萄糖产生H_2O_2,复合材料表面的ZnFe_2O_4催化H_2O_2氧化TMB,溶液的颜色从无色转变成蓝色,当葡萄糖的浓度增加时,反应溶液的颜色越来越明显,根据溶液中葡萄糖浓度与溶液吸光度变化的关系实现葡萄糖的灵敏检测。最低检测限为0.58μM,线性检测范围为0.8-250μM。利用本方法检测实际样品人血清中的血糖浓度,与临床检测结果相比,葡萄糖加标回收率为100%-107%。本方法建立的三元复合体系具有以下优点1)采用一步法制备ZnFe_2O_4/CNT,制备方法简单;2)ZnFe_2O_4/CNT-GOD三元复合材料和葡萄糖发生级联反应减少了中间产物H_2O_2的扩散,加快了电子传递速率和反应速率;3)ZnFe_2O_4和CNT大的比表面积提高了酶的负载效率;4)三元复合探针选择性好,葡萄糖类似物和多种金属离子对检测均无干扰;5)与文献报道的ZnFe_2O_4和Fe_3O_4单一体系对比,ZnFe_2O_4/CNT催化效果明显增强。本研究有助于后期构建多元复合探针及其他生物分子灵敏快速检测方法的发展。