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苦参水提药渣中异戊烯基黄酮类物质资源价值发现

曹雅琦  
【摘要】:随着中药产业的大力发展,中药材的需求量也日益增加,中药资源已成为国家战略资源。然而多数中药制剂仅提取其中极少数类型的化学成分,产生大量的中药药渣,给环境造成巨大的压力;同时部分中药材生长在生态脆弱的西部地区,长期无计划地采挖给当地生态环境造成极大的破坏。充分挖掘中药药渣剩余资源价值,促进中药资源循环利用,是实现中药资源可持续开发的重要途径之一。苦参主要分布于我国西北地区,其药材在中药工业中主要用于制备苦参生物碱类成分,与此同时产生大量酸水提取药渣。然而,苦参(酸)水提药渣中含有大量的异戊烯基黄酮类成分,该类成分含量可观,制备工艺简单,且具有广泛的生物活性。通过苦参水提药渣中异戊烯基黄酮类物质资源价值发现可以为苦参药材的资源循环利用及可持续发展提取依据。本课题以苦参水提药渣为研究对象,制备异戊烯基黄酮类活性部位及单体成分,研究其抑菌构效关系及作用机制。在上述体外研究基础上,进一步采用小鼠乳腺炎整体动物模型,探索苦参异戊烯基黄酮活性部位及其不同配伍体内抑菌抗炎活性及其作用机制。为扩大苦参异戊烯基黄酮类成分在药学中的应用范围,采用网络药理学技术挖掘苦参异戊烯基黄酮类成分对应的疾病靶点,结果表明该类成分对二型糖尿病具有较高的匹配度;进一步应用分子对接技术评价苦参异戊烯基黄酮类成分与糖尿病关键靶点的结合能力,为苦参水提药渣中异戊烯基黄酮类成分对二型糖尿病新药研发提供依据。通过该论文的研究,以期为苦参水提药渣中异戊烯基黄酮类成分在畜牧养殖业替代抗生素研究及二型糖尿病新药创制提供支撑,为苦参水提药渣的资源价值发现及苦参药材的资源循环利用提供科学依据。本论文共分为以下四章内容:第一章文献研究本部分归纳总结了苦参异戊烯基黄酮类成分的结构表征与药理活性,以及对该类成分的知识产权情况进行了分析,以期为苦参异戊烯基黄酮类化合物的开发利用提供理论依据。第二章苦参异戊烯基黄酮类化合物抗菌活性、构-效关系及抗菌机制研究1.运用的方法为正交工艺考察法,其指标为苦参总异戊烯基黄酮的含量,对提取苦参异戊烯基黄酮的方法进行探索;实验证明,苦参异戊烯基黄酮的最佳提取工艺为:乙酸乙酯渗漉法提取,料液比1:4,浸泡时间24h,流速为3ml.min~(-1)渗漉次数为6次。按照该方法对苦参药渣进行提取,总黄酮得率为2.53%,采用紫外分光光度法测得所得浸膏中总黄酮含量为50.12%,此外运用液质联用来定性分析苦参黄酮的成分,总计得到共20种黄酮类成分,异戊烯基取代黄酮类化合物为18个。2.分离苦参总异戊烯基黄酮后总计获得6个单体化合物,各自是Isoxanthohumol、Kushenol、Kurarinone、Sophoraflavanone G、Kushenol A与Leachianone A,之后采用微量肉汤稀释法,以最小抑菌浓度(MIC)为指标,评价苦参异戊烯基黄酮类化合物对大肠杆菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用,同时与非异戊烯基取代黄酮的抑菌活性进行比较,初步探讨该类黄酮的抑菌构-效关系。结果表明,该类化合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌与痢疾杆菌无显著抑菌活性,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌与产气荚膜梭菌有显著抑菌活性,抗金黄色葡萄球菌活性最强,构效关系表明异戊烯基取代黄酮类化合物抑菌作用显著强于非异戊烯基取代黄酮,其8位异戊烯基取代以及3位5位羟基化对其抑菌活性有增强作用,其5位甲基化对其抑菌活性有减弱作用。3.通过核磁代谢组学方法,以kurarinone为例,探讨该类化合物抑制金黄色葡萄球菌生长的抑菌机制,结果显示,抑菌活性可能由于kurarinone干扰金黄色葡萄球菌的氨基酰基的tRNA生物合成;谷胱甘肽代谢;甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸的代谢过程有关。第三章苦参异戊烯基黄酮及联用组抗小鼠乳腺炎效应评价及机制研究1.采用微量棋盘稀释法,以FIC指数为评价标准,评价苦参异戊烯基黄酮及其联用组对金黄色葡萄球菌的抑制作用,同时建立金黄色葡萄球菌所致小鼠乳腺炎模型,以脏器指数、乳腺组织菌落计数、组织切片及炎症因子水平为评价指标,探讨苦参异戊烯基黄酮及其联用组体内抑菌抗炎活性,体内抑菌抗炎实验结果显示,苦参异戊烯基黄酮及其联用组对小鼠乳腺炎各项指标均有一定改善作用。单用时,苦参异戊烯基黄酮对乳腺组织载菌量及脏器指数优于甘草黄酮与苦参生物碱,联用时,苦参异戊烯基黄酮-苦参生物碱组与苦参-甘草联用组对乳房炎小鼠脏器指数、组织载菌量的改善作用优于单用组,有协同增效作用;单用时,甘草黄酮对模型组小鼠乳腺组织病理学改善作用及对炎症因子IL-1β、IL-2、TNF-α的降低作用均优于苦参异戊烯基黄酮与苦参生物碱,联用时,苦参异戊烯基黄酮与甘草黄酮联用组具有协同增效作用。结果表明苦参异戊烯基黄酮与苦参生物碱联用组在抑菌方面更体现协同增效作用,苦参异戊烯基黄酮与甘草黄酮联用组在抗炎方面更体现协同增效作用。2.基于UPLC-QTOF/MS技术,采用代谢组学,研究苦参异戊烯基黄酮对金黄色葡萄球菌所致乳腺炎小鼠的干预机制,结果显示,在小鼠的尿液、血液及组织样本中,共找到45个差异性代谢物,研究表明,苦参异戊烯基黄酮可抗小鼠乳腺炎活性可能与其影响了影响了丙酸盐代谢、醚脂代谢、组氨酸代谢以及萜类骨架生物合成等生物代谢过程有关。第四章苦参异戊烯基黄酮类成分网络药理学研究为了深入挖掘苦参异戊烯基黄酮类成分抗菌抗炎以外的其他资源价值,预测苦参异戊烯基黄酮类成分可能的药理活性和作用靶点及信号通路,本章通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)、中国知网(CNKI)和PubMed数据库汇总苦参异戊烯基黄酮类成分;通过Swiss Target Prediction平台对苦参异戊烯基黄酮类成分进行靶标预测,利用DAVID平台对预测靶点进行疾病相关性分析;运用Cytoscape 3.7.2构建“中药-化合物-靶点”网络;利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络;将疾病富集到的基因进行KEGG通路和GO功能富集分析,并运用Rversion 3.6.3软件将结果进行可视化;采用AutoDock vina 1.1.2进行分子对接研究。共找到54个苦参异戊烯基黄酮类成分成分对应170个靶标基因,疾病相关性分析结果显示苦参异戊烯基黄酮类成分的靶标基因与二型糖尿病密切相关,PPI网络分析表明苦参异戊烯基黄酮类成分治疗二型糖尿病可能与PTPN1、AKT1和HSD17B1等基因蛋白相关;GO及KEGG富集分析得出苦参异戊烯基黄酮类成分治疗二型糖尿病作用相关的生物过程147个(P0.05),相关信号通路31条(P0.05);分子对接结果显示其中,Alpinumisoflavone与PTPN1具有较强的结合能力,且结合能力强于阳性药Glibenclamide;Flavescenone C、Kushenol V与HSD17B1均展现出较好的结合能力,且结合能力强于阳性药Glibenclamide;kushenol F与AKT1的结合能力最强,结合能略弱于阳性药Glibenclamide。表明苦参异戊烯基黄酮类化合物是潜在的治疗二型糖尿病的活性成分,其可作用于PTPN1、AKT1和HSD17B1等靶点,调节多条信号通路,从而发挥对二型糖尿病的治疗作用。


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