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人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成机制的初步研究

张杰  
【摘要】:人参(Ginseng Radix et Rhizoma)为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的干燥根和根茎,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效,是我国名贵中药材。本课题组前期研究结果表明,人参“优质”即人参皂苷类成分积累对其“优形”即根的性状特征具有重要意义,为了进一步阐明人参外在性状与内在质量的关系,本论文通过筛选人参根型建立的关键基因WOX(Wuschel-like homeobox)转录因子,并对其参与调控人参皂苷生物合成的机制进行了初步研究,以期为人参“优形、优质”成因研究奠定基础。本文构建获得5个WOXs基因的过表达与RNAi干扰载体,利用转基因毛状根体系,最终获得PgWOX11转基因毛状根。对转基因材料的基因表达分析,发现PgWOX11对ERF1B、ERF114b与PgIAA13基因具有正调控作用。进一步,对PgWOX11可能调控的ERF家族成员进行分析,结果发现4个ERF基因很可能对人参皂苷生物合成具有负调控作用,其中ERF1B受PgWOX11正调控。本研究为探究人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成的机制作铺垫,为探索人参外在性状与内在质量的关系提供依据。主要研究内容如下:1.人参WOXs基因对人参皂苷的响应研究采用原人参二醇型人参皂苷GS1和原人参三醇型GS2处理人参不定根,并作转录组分析。结果表明,(1)人参皂苷对人参不定根的干细胞网络具有调控作用,且WOXs基因是人参干细胞的关键基因;在此基础上,依靠实时荧光定量PCR分析了各处理组人参WOXs基因的表达情况变化。筛选获得5个响应人参皂苷处理的PgWOX。(2)筛选获得6个与PgWOX11表达模式一致的ERF基因(ERF13、ERF113、ERF114a、ERF114b、ERF110和ERF1B)和1个IAA13基因。2.人参WOXs基因的克隆及生物信息学分析第一次从人参根总cDNA克隆获得5个WOXs基因,分别命名为PgWOX4、PgWOX5、PgWOX11、PgWOX13a和PgWOX13b;上述基因编码蛋白均包含Homeobox结构域。3.人参WOXs基因的植物表达载体构建及转基因毛状根对人参PgWOX4、PgWOX5、PgWOX11、PgWOX13a、PgWOX13b基因作了全长cDNA和RNAi干扰片段的克隆;依靠Gateway技术构建了过表达及RNAi干扰载体;采用农杆菌介导法,诱导获得过表达及RNAi干扰PgWOX11转基因毛状根,利用PCR检测GFP基因结果为阳性。4.人参PgWOX11对人参ERF的调控研究以转空载的毛状根为对照,运用PgWOX11过表达及RNAi转基因毛状根对6个前期筛选到的与PgWOX11表达模式一致的基因进行表达分析,结果发现在PgWOX11基因过表达毛状根中ERF1B、ERF114b与PgIAA13高表达,而在PgWOX11基因RNAi毛状根中ERF1B、ERF114b与PgIAA13低表达,说明ERF1B、ERF114b与PgIAA13受到PgWOX11的正调控,推测它们之间可能具有直接互作关系。由于ERF转录因子为植物萜类代谢关键的调控因子,因此PgWOX11是否通过ERF转录因子进而影响人参皂苷合成值得进一步探索。5.人参ERF基因对人参皂苷生物合成的调控研究通过人参转录组热图聚类分析,从不同部位和不同生长年限两个层面对比获得6条可能参与人参皂苷生物合成的ERF基因,即ERF1B、ERF003、ERF012、ERF026、ERF034、ERF118。利用茉莉酸甲酯MeJA改变内源性人参皂苷含量,对筛选到的6个ERF基因进行表达分析,发现ERF003、ERF118、ERF012表达量均出现显著下降,与CYP716A53v2趋势一致,而与DDS趋势相反,ERF1B与CYP716A47表达模式相反。结合相关性分析可以推断,ERF1B很可能与CYP716A47存在负调控;ERF003、ERF118、ERF012很可能与DDS存在负调控,而与CYP716A53v2存在正调控。结合之前研究,ERF1B、ERF114b与PgIAA13受到PgWOX11的正调控,可以推测PgWOX11极有可能通过调控ERF1B来达到调控人参皂苷合成的调控环。


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