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粉防己碱生物合成途径候选功能基因筛选及去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶的功能研究

李琦爽  
【摘要】:中药防己是防己科植物粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)的干燥根,在我国具有悠久的药用历史。现代研究表明,防己的活性成分为粉防己碱,具有抗尘肺、抗高血压、抗炎、抗肿瘤等药理作用。但随着需求的增长和野生资源的破坏性挖掘,逐渐出现粉防己价格上涨、供不应求的局面。粉防己碱属于苄基异喹啉类生物碱。目前,包括吗啡在内的多种苄基异喹啉类生物碱的生物合成途径已经得到完全解析并实现了工程化生产,但粉防己碱等双苄基异喹啉类生物碱的生物合成仍然鲜有报道。为了实现粉防己碱生物合成途径的完全解析及粉防己碱的异源生产,本研究对粉防己进行了转录组测序,并通过代谢组和转录组联合分析获得了一系列可能参与粉防己碱生物合成的功能基因;在BIAs生物合成上游途径中,6OMT是一个关键酶,所以本研究对获得的St6OMTs基因进行克隆和异源表达,并通过体外酶促反应验证了基因功能。主要研究内容如下:1.比较转录组学分析筛选粉防己碱生物合成途径候选功能基因对粉防己根皮、根、茎、叶四个组织部位进行相关生物碱相对含量测定,发现相关生物碱在地下部分的含量远高于地上部分。接着采用二代联合三代测序技术对以上四个组织部位进行转录组测序,从转录组数据中获得38条NCS基因,12条6OMT基因,64条CNMT基因。再结合生物碱积累模式,筛选出在地下部位表达量较高的可能参与粉防己碱粉防己碱生物合成下游途径的基因,其中包括12条O-甲基转移酶基因,23条CYP450基因。获取的这些转录组数据将为上游基因的功能验证和下游途径的完全解析提供前提。本研究对粉防己进行转录组测序,通过化合物相对含量和转录组联合分析筛选出粉防己碱生物合成相关基因,为后续功能基因的验证打下基础。2.粉防己6OMT基因的全长克隆及序列分析根据转录组测序获得的6OMT基因设计引物,以根皮cDNA为模板,克隆得到4条St6OMTs基因并对其进行了生物信息学和基因表达分析。将St6OMTs翻译成氨基酸序列后与已验证功能的6OMT进行多序列比较发现4条St6OMTs均具有6OMT特征性保守序列,在进化树分析中,St6OMT1更多的与已知功能的其他植物中的6OMT聚集在一起。在基因表达分析中,St6OMT1和St6OMT2在地下部分的相对表达量远高于地上部分,而St6OMT3和St6OMT4在各组织部位的相对表达量均较低。本研究克隆得到粉防己的6OMTs并进行了序列分析,为基因功能的体外验证指明方向。3.粉防己6OMT基因的表达及功能验证利用无缝拼接技术将克隆得到的St6OMTs基因构建到原核表达载体pET32a上,并且成功转化到BL21(DE3)菌株表达出相应可溶性蛋白,然后以(S)-norcoclaurine为底物,以S-adenosyl-L-methionine为甲基供体进行体外酶促反应以验证基因功能。结果表明St6OMT1可以催化(S)-norcoclaurine生成预期产物(S)-coclaurine。在St6OMT2的反应体系中则检测到一个m/z为300的未知色谱峰,推测其为连续甲基化的产物,但还需要进一步研究。St6OMT3和St6OMT4则没有表现出对底物(S)-norcoclaurine的催化活性。本研究验证了粉防己碱生物合成途径中6OMT的功能,为完全解析粉防己碱生物合成途径奠定基础的同时,也为苄基异喹啉类生物碱的异源生产提供了新的可供选择的生物元件。


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