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杆状病毒AcMNPV与家蚕二分浓核病毒嵌合体病毒的构建及其特性分析

孙伟娟  
【摘要】:家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV),隶属于二分DNA病毒科,二分浓核病毒属,其基因组含有两个大小分别为6.5 kb(VD1)和6 kb(VD2)的线性单链DNA节段。BmBDV特异性侵染家蚕中肠柱状上皮细胞,引发家蚕罹患类似昆虫浓核症,是蚕业经济减产的主要病原之一。目前还没有一种体外培养细胞系支持BmBDV感染,使得BmBDV的增殖与基因功能研究受到极大限制,病毒的入侵和复制机制、病毒的基因功能、病毒基因的表达调控机制能等方面还远未阐明,构建稳定高效的能拯救BmBDV的反向遗传体系尤为重要。通过克隆质粒对病毒进行拯救是一种有效策略,苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的基因组可看做一大质粒,能够容纳约100 kb的外源DNA,在敏感细胞中高效复制。本研究拟利用Bac-to-Bac系统将BmBDV的基因组插入到AcMNPV中,构建AcMNPV与BmBDV嵌合体重组病毒,分析嵌合体病毒的复制特性。首先,我们在不破坏基因组完整性的情况下,分别在VD1编码蛋白NS1和VP的C-末端融合Flag标签,在VD2基因组非编码区内插入标记基因eGFP完整表达盒,通过酶切酶连接的方法成功构建了包含BmBDV基因组和标记基因的重组转座质粒:pVD1-NS1Flag、pVD1-VPFlag和pVD2-GFP。重组质粒转染Hi5细胞,WesternBlot能够检测到NS1,VP蛋白的表达,VD2重组质粒能够在Hi5细胞内表达荧光。其次,利用Bac-to-Bac系统成功构建包含VD1或VD2融合特异标记的嵌合体病毒Ac-VD1/NS1Flag,Ac-VD1/VPFlag和Ac-VD2GFP。RT-PCR和Western-Blot分析表明BmBDV基因能够随嵌合体病毒在昆虫细胞Hi5内进行转录和表达,基因表达模式与野生型病毒感染家蚕中肠相似。然后,我们用重组病毒单独感染或共感染Hi5细胞,感染96 h后收集细胞裂解液,喂食感性品系华八三五二龄家蚕幼虫,在添食病毒感染的细胞裂解液的家蚕中未观察到典型的BmBDV感染症状,在家蚕中肠中也没有观察到eGFP的表达;取家蚕中肠通过RT-PCR和Western Blot分子生物学技术分析也并未检测到BmBDV基因的复制和表达。这些结果表明,BmBDV没有随重组病毒在Hi5细胞中的复制而获得拯救。Southern Blot结果表明,在重组病毒感染的Hi5细胞中,BmBDV基因组不能从嵌合体病毒中得以拯救。综上所述,我们成功构建了融合特异标记的BmBDV与AcMNPV的嵌合体病毒,BmBDV的基因能随嵌合体病毒在Hi5细胞中表达,但因为BmBDV的基因组不能从嵌合体病毒基因组中释放出来,所以不能在Hi5细胞中拯救出有感染性的BmBDV粒子。我们的研究为深入研究BmBDV基因的表达调控机制提供了一种便捷的平台,并为创建新型生物防治剂,比如杆状病毒与浓核病毒及其他昆虫病毒的嵌合体病毒打下了基础。


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