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黄曲霉毒素B_1单克隆抗体的制备及其在中药材污染快速检测中的应用

蒋佳伊  
【摘要】:中药材以植物性来源为主,在未能及时干燥、储存不当或因其他外界条件影响时,易发生霉变从而污染黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)。其致癌性极强,可引发肝、肾毒性,抑制免疫系统等,对人体健康带来极大损害。因此,为了有效控制中药材AFB_1污染,保障中药品质和用药安全性,研究高效灵敏的快速检测方法十分重要。目前传统的用于中药材AFB_1的检测方法主要为仪器分析法,包括高效液相以及液质联用等,但其样品前处理繁琐、耗时且操作要求高等,导致在大批量中药材AFB_1筛查应用中具有局限性。而基于抗原抗体特异性识别的免疫学检测技术(ELISA、GICA等)具有操作简单、高通量以及可进行现场检测等特点,可作为实验室仪器分析检测技术的有效补充,但是受中药材复杂基质的影响,其在中药检测中需要更高的检测灵敏度和稳定性。基于此,本论文开展了以下研究:获取高灵敏的抗体是免疫学检测技术建立的最重要前提。首先,本研究通过改进的肟化法改造AFB_1后,将其与BSA和OVA进行偶联,成功获得AFB_1完全抗原,反应无需加热,且未使用苯等有机溶剂,有利于环境保护。此外,采用加大免疫剂量、皮下多点和腹腔注射相结合的方式对Balb/c雌鼠进行免疫,方法中增加了免疫部位,使免疫更加充分,经细胞融合及多次克隆筛选后获得三株稳定的AFB_1单克隆细胞株1E5、1E6以及1F7,选择抑制AFB_1效果最好的1F7细胞株通过诱生腹水法并纯化以获得大量的AFB_1单克隆抗体。该抗体免疫特性鉴定结果显示其属于IgG_(2b)型抗体,灵敏度(IC_(50))可达0.15μg/L,亲和力常数为2.81×10~8 L/mol,与AFB_2、AFG_1、AFG_2、AFM_1交叉反应率分别为35.07%、8.75%、1.15%、36.75%,且与其他类真菌毒素几乎不存在交叉反应,表明本研究制备的抗体在保证高特异性和高亲和力的同时,具有较高的灵敏度,可用于AFB_1快速检测方法开发及生产应用。以高通量快速检测为目的,基于制备得到的AFB_1单克隆抗体,以易污染中药材酸枣仁为研究对象,通过系统优化同时结合基质匹配标准曲线以消除基质效应干扰,建立了高灵敏的中药材AFB_1的间接竞争酶联免疫分析(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测方法,检测限可达1.69μg/kg,AFB_1在0.05~0.58μg/L范围内线性良好(R~2=0.992),加标回收率为88%~119%。采用所建立的方法对33批酸枣仁中AFB_1进行了测定,并采用HPLC-MS/MS对检测结果进行了对比和确证,结果显示,ELISA检测结果无假阳性和假阴性,将两种方法所测得的含量数据进行线性拟合,相关系数R为0.996,表明本研究中建立的ic-ELISA方法准确、可靠,可用于实际酸枣仁样品初筛,同时可为其他中药材AFB_1的快速筛查提供参考。此外,以现场快速检测为目的,研究中利用制备的AFB_1单克隆抗体,开发了两种不同检测形式的胶体纳米金探针的免疫层析试纸条,即以金标抗体是否固定化分为湿法试纸条法(W-GICA)和干法试纸条法(D-GICA)。研究中重点考察了免疫层析试纸条构建过程中的关键参数,包括抗体与胶体金偶联的pH、抗体偶联量以及抗原浓度等条件。经优化后,W-GICA检测AFB_1标准溶液的可视检测限为0.25 ng/mL,灵敏度为0.5 ng/mL,而D-GICA的可视检测限只能达到1 ng/mL。因此最终选择更加灵敏简便的W-GICA法,用于中药材中黄曲霉毒素B_1的检测。本研究中选取易污染,同时富含色素的酸枣仁为模式研究样品,检验方法的适用性。结果表明,样品仅需经简单提取后进行一步稀释,其可视检测限即可达到5μg/kg,满足现行《中国药典》及欧盟对中药材中AFB_1污染限量标准水平的检测需求。33批酸枣仁样品中试纸条测定结果有12批超标,通过HPLC-MS/MS验证结果一致,该方法中有效地避免了很多快检方法中所采用的样品浓缩步骤,同时还可通过对样品提取液稀释以降低基质干扰,可实现中药材在产地初加工、仓储过程中等现场的快速筛选。


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