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小鼠GITRL蛋白对CD4~+CD25~+T细胞功能影响的初步研究

鲍俊峰  
【摘要】: 目的: 体外表达小鼠糖皮质激素诱导的TNF家族相关配体(mGITRL),观察其对CD4~+CD25~+T细胞功能及Foxp3表达的影响;体外原核表达小鼠Foxp3蛋白(mFoxp3),并制备多克隆抗体。 方法: (1)以质粒GITRL-pET-32a作为模板,PCR扩增获得mGITRL_(aa45-173)基因的PCR产物;bglⅡ、pstⅠ双酶切PCR产物和真核表达质粒pDisplay,连接酶切产物,转化至感受态E.coli DH5a;选择阳性菌株,抽提重组质粒,bglⅡ单酶切及PCR进行鉴定质粒。使用脂质体介导法转染HEK293细胞,培养48小时后收集细胞培养上清,SDS-PAGE电泳检测mGITRL_(aa45-173)真核蛋白表达,并通过Western blot进行鉴定。 (2)免疫磁珠法分离小鼠脾脏来源的CD4~+CD25~+T细胞、CD4~+CD25~-T细胞,以及人CD4~+T细胞;流式细胞术检测小鼠CD4~+CD25~+T细胞的纯度及细胞表面GITR的表达。将mGITRL原核蛋白加到小鼠CD4~+CD25~-T细胞的培养体系,或小鼠CD4~+CD25~-T细胞和小鼠CD4~+CD25~+T细胞的混合培养体系,或人CD4~+T细胞的培养体系,或人CD4~+T细胞和小鼠CD4~+CD25~+T细胞的混合培养体系,通过[~3H]TdR掺入法检测T细胞增殖情况。将mGITRL原核蛋白加入小鼠CD4~+CD25~+T细胞培养体系,在不同时间收集细胞,提取RNA,采用RT-PCR方法,半定量检测Foxp3基因的转录水平变化,Western blot检测Foxp3蛋白表达变化。 (3)以质粒mFoxp3-pMD-18T作为模板,PCR扩增获得小鼠Foxp3全长基因的PCR产物;EcoRⅠ、SalⅠ双酶切PCR产物和原核表达质粒pET-32a,连接酶切产物,转化至感受态Ecoli BL-21;选择阳性菌株,抽提重组质粒,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切及PCR进行鉴定质粒。接种阳性菌株LB培养基,1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测mFoxp3融合蛋白的表达情况;将所表达的目的蛋白用Profinity IMAC Nickel柱分离纯化,纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。将纯化蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,三次免疫后收集兔血清,ELISA法检测兔抗小鼠Foxp3抗体效价,Western blot检测抗体特异性。 结果: (1)构建真核表达载体mGITRL_(aa45-173)-pDisplay,经PCR鉴定可见387bp的目的条带,测序结果显示与GenBank中发表的序列完全一致。以梭华-Sofast~(TM)/阳性质粒DNA(v/m)2:1比例转染HEK293细胞株,培养48h后在细胞培养上清中检测到mGITRL_(aa45_173)蛋白的表达,分子量大小约为14.5KD。 (2)免疫磁珠法分离获得的小鼠CD4~+CD25~+T细胞,纯度在85%左右;流式细胞术检测显示小鼠CD4~+CD25~+T细胞表面表达GITR。mGITRL可刺激小鼠CD4~+CD25~-T细胞增殖,解除小鼠CD4~+CD25~+T细胞抑制CD4~+CD25~-T细胞增殖的作用,并且mGITRL的这种功能可直接作用于小鼠CD4~+CD25~+T细胞。mGITRL可促进小鼠CD4~+CD25~+T细胞增殖,进一步研究发现当mGITRL作用于小鼠CD4~+CD25~+T细胞8h后,可下调Foxp3基因的表达,12h后下调Foxp3蛋白的表达。 (3)构建原核表达载体mFoxp3-pET-32a,经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切及PCR鉴定均可见1287bp的目的条带,测序结果显示与GenBank中发表的序列完全一致。原核表达载体mFoxp3-pET-32a成功转化至感受态Ecoli BL-21后,终浓度1 mmol/L IPTG、30℃、诱导4h为最佳蛋白诱导条件,融合蛋白分子量大小约为62KD;经Profinity IMAC Nickel柱纯化后蛋白纯度>90%。ELISA法检测兔抗小鼠Foxp3抗体效价为1:20000,Western blot检测结果显示该抗体能与mFoxp3蛋白特异性结合。 结论: (1)成功构建真核表达载体mGITRL_(aa45_173)-pDisplay,并在HEK293细胞中表达目的蛋白。 (2)mGITRL蛋白能解除小鼠CD4~+CD25~+T细胞抑制CD4~+CD25~-T细胞增殖的作用,并且这种作用可能与其下调CD4~+CD25~+T细胞Foxp3的表达有关。 (3)成功表达小鼠Foxp3原核蛋白并制备多克隆抗体。


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