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《江苏大学》 2007年
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家蚕抗核型多角体病毒病的微卫星分子标记筛选、定位及其病毒侵染家蚕中肠组织的差异蛋白质表达图谱研究

赵远  
【摘要】: 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是昆虫病毒史上首先发现的。由BmNPV引起的家蚕核型多角体病毒病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种。该病在世界养蚕业国家常有暴发,传染极强,难以控制,危害最为严重,常造成巨大的经济损失。目前,四川、浙江、江苏、广东等蚕业主产区,每年由BmNPV引起蚕茧损失,约占蚕病总损失的70%~80%。蚕业界学者多年来一直希望寻找抗病基因、阐明抗性机理、培育抗性品种,至目前为止,在很多领域己取得一定的进展,但仍然有很多问题未能解决。 本研究利用抗BmNPV品系NB,敏感性品系306建立回交群体BC_1,利用已经构建的SSR分子标记连锁图,进行抗NPV基因分子标记筛选及连锁定位分析,并尝试分子标记辅助育种技术培育新种质。同时,通过构建近等基因系,采用2-D电泳和质谱相结合的技术,研究BmNPV感染途径相关的中肠组织的蛋白质组时空变化图谱,从蛋白质组水平揭示家蚕对BmNPV的应答模式,通过与对照蛋白质组图谱的比较,希望发现一些与抗性相关的特异性蛋白标志物、参与免疫作用相关的蛋白、参与生命活动的必需蛋白以及其他差异蛋白,为BmNPV病的早期诊断、开发防病新途径和抗病育种提供理论基础。 主要研究成果如下: 1、在两条染色体上筛选出8个与抗NPV基因连锁的分子标记并进行了定位。利用家蚕减数分裂过程中雌性染色体上的基因不发生交换而雄性染色体上的基因发生交换的特点,用高抗BmNPV家蚕品系NB和高敏感家蚕品系306以及2种类型的回交群体为研究材料,即(306×NB)♀×306♂和306♀×(306×NB)♂,分别记作BC_1F和BC_1M,从已经公布的SSR分子连锁图中共选择103个分子标记特异引物进行抗BmNPV分子标记筛选。用BC_1F群体22个体在第3连锁群上筛选到5个与抗性基因KN1连锁的SSR标记,在第25染色体上筛选到3个与抗性基因KN2连锁的SSR标记。用BC_1M群体192个个体检测,对这些标记和抗NPV基因进行了定位;在第25连锁群上抗NPV基因位于10.8cM处,最近的引物为LFL0442,排列顺序LFL0442、KN_2、LFL1125和LFL0771;在第3连锁群上抗NPV基因位于45.3cM处,最近的引物为LFL0454,排列顺序LFL0542、LFL0773、LFL1148、KN_1、LFL0454和LFL0326。 2、采用构建近等基因系的方法创建新种质。利用分子标记辅助育种原理,采用连续回交方法将抗BmNPV基因导入到多丝量优良品种C_(03)中。选择采用常规接种病毒和分子标记辅助育种技术,经过6代回交、接种选择,3代自交,获得对抗BmNPV基因的家蚕新种质“新月”,其经济性状与C_(03)已经接近。实验表明通过分子标记育成的新种质与通过常规育种育成的品种经济性状相差很小,但是通过分子标记辅助选择时间短,规模小,通过检测后代SSR标记,抗性基因留下的可能性更大。 3、利用二维电泳技术和质谱技术,在五龄起蚕接种NPV后不同品种不同时间段接种和对照的家蚕中肠组织蛋白表达图谱中筛选出36种已知蛋白并对部分蛋白功能进行分析。以高抗BmNPV的NB品系,高感品系306及以NB、306杂交和回交构建的近等基因系BC8为研究模型,采用蛋白质双向电泳和质谱联用技术,对模型中3个材料,采用接种BmNPV和对照两种组合方式,在五龄起蚕接种NPV后24h、48h、72h进行中肠组织的蛋白差别分析,获得了家蚕三个品种在三个阶段对BmNPV在蛋白质水平上的差异表达图谱。从同一品种同时间段、同一品种不同时间段、不同品种同一时间段对NPV入侵家蚕中肠组织蛋白差异表达图谱进行讨论。选取差异蛋白点胶内酶切后质谱鉴定,对肽指纹图谱在NCBI蛋白数据库里搜索,在18块凝胶上切取了具有明显差异蛋白点256个,通过质谱分析,得到64个点通过数据库比较获得比较满意(得分大于79,或者比对与家蚕同源蛋白,有部分是相同的蛋白)的结果,即是该蛋白的可靠性大于99.5%,利用MASCOT软件对这些结果进行比对分析,共鉴定出了36种已知蛋白质。可能与NPV抗性相关的蛋白:精氨酸激酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、天门冬氨酸氨基转移酶、硫醇抗氧化酶。可能参与免疫作用相关的蛋白:烯酰CoA水合酶、磷酸丙糖异构酶、热休克蛋白。参与生命活动必须的相关蛋白:二氢硫辛酰胺脱氢酶、磷脂酰乙醇胺、型H—ATPase、凝乳蛋白酶抑制剂CI-8A、延胡索乙酰水解酶。其他蛋白:类IDGF蛋白、DNA解旋酶、原肌球蛋白、转录延长因子蛋白、肌动蛋白解聚因子等等。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S884

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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