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《江苏大学》 2010年
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水菖蒲内生菌的分离及其抑菌活性的研究

周晓坤  
【摘要】: 水菖蒲(Acorus calamus Linn.)作为一种传统的民间药,长期生长在污泥这种特殊的环境中,国内外文献研究表明具有很好的抑菌杀虫活性。 植物内生菌能产生大量新的天然产物,有些内生菌还可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物,已成为天然产物潜在的重要资源。本研究对水菖蒲内生菌进行了分离,得到113株内生菌,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌对其抗菌活性进行筛选,研究了菌株S9,S15,S24和S70的抗菌活性。发现S9具有广谱的抑菌活性,对其进行了抑菌活性物质与菌株鉴定、生理条件与稳定性,培养基条件的优化以及水菖蒲抑菌活性的相关研究。本研究旨在探索从水菖蒲内生菌中发现抑菌活性成分的可能性,为研究新的天然产物抑菌药物提供思路。主要研究内容如下: (1)采用75%乙醇、次氯酸钠溶液浸泡和无菌水洗涤、培养、分离的方法从水菖蒲内分离内生菌。研究表明:应同时设置超净工作台无菌状态检测对照、漂洗液检测对照和组织印迹检测对照等3种对照处理,确保内生菌分离准确性。水菖蒲体内存在内生菌且种类繁多、十分丰富,共分离到113株内生菌,根茎、叶中均有分布,叶中的内生菌数量明显少于茎中。 (2)用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和稻瘟霉作为初筛指示菌,分别代表了G~+,G~-菌,真菌,对分离得到的113株水菖蒲内生菌进行了抗菌活性初筛,有50株菌对稻瘟霉P-2b具有抑制作用,46株对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌有抗菌活性的菌株,分别占所有菌株的44.2%和40.7%,表明水菖蒲中有丰富的有抑菌活性的内生菌资源。对抑菌效果最强的四株菌—S9、S15、S24、S70,进行了进一步的抗菌能力研究。结果表明,S9对多种指示菌都有很好的抑制和杀灭效果。 (3)研究了活性菌株S9发酵1-14天的生长特性,并检测了生物量,pH值,残糖量和对指示菌的最小抑菌浓度。结果显示发酵液在1-3天进入对数增长期,第4-6d为稳定期,从第7d开始进入衰亡期,在整个过程中,生物量、pH、发酵液中的残糖量和抑菌活性变化显著。 (4)研究了S9发酵液对温度、光照、pH值和传代等的稳定性。结果表明,发酵液对温度、光照有较好的稳定性,1-7代内菌株抑菌活性无明显改变。但pH值对发酵液的活性影响较大,在偏酸的环境下,活性较好,在碱性环境下无活性。并初步研究了S9发酵液的活性部位,结果表明S9发酵液的活性成分存在于胞外产物,胞内物质基本无抑菌活性;同时,发酵液中的多糖蛋白等大分子物质无抑菌活性。 (5)通过单因素试验,Plackett-Burman试验和响应面法对水菖蒲内生菌S9的发酵条件进行了优化,结果表明水菖蒲内生菌S9的最佳发酵条件为温度28℃,蔗糖用量26 g·L~(-1),pH值为6.7,培养基装液量50mL,转速140 r/min,KH_2PO_4为1mmol/L,马铃薯加入量为250 g·L~(-1),酵母膏的含量20 g·L~(-1)。 (6)采用五部分离法,研究了水菖蒲内生菌S9发酵产物各极性部位的抑菌活性,初步判定其最强的抑菌活性部位为石油醚相,对各种细菌、丝状真菌和酵母菌均有不同程度的抑制作用,对各种指示细菌的最小抑菌浓度(MIC)为15-30μg·mL~(-1),对指示细菌的最小杀菌浓度为30-60μg·mL~(-1);对四种酵母样真菌的最小抑菌浓度为12.5-50μg·mL~(-1):对六种丝状真菌的最小抑菌活性为15-500μg·mL~(-1)。并通过形态鉴定和ITS序列分析,鉴定水菖蒲内生菌S9为木霉属,其与Hypocrea lixii sp.属中的各菌株具有极高的同源性高达98%。通过GC-MS分析,结果表明其石油醚相的主要成分为2-(2,2-二甲基亚丙基)环己烷-1,3-二酮。 (7)研究了S9内生菌的宿主植物水菖蒲各极性部位的抑菌活性,其中石油醚相对各种指示细菌和丝状真菌表现出了较好的抑菌效果,并对其相进行的GC-MS分析,结果表明其主要成分为1-甲氧基-4-乙炔基苯。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R282.7

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